王 敏，傅 強(qiáng)，馬占強(qiáng)，馬世平

中國(guó)藥科大學(xué)中藥藥理教研室，南京 211198

缺血性腦血管病是一種常見病和多發(fā)病，是目前嚴(yán)重危害人類健康與生命的主要疾病之一，因具高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率和高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)而引起國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注與高度重視[1]。抑肝散出自于《保纓撮要》，由當(dāng)歸、鉤藤、茯苓、白術(shù)、川芎、柴胡及甘草等組成，主治神經(jīng)癥、不眠癥、小兒夜啼等。近年來，中日兩國(guó)學(xué)者應(yīng)用該方治療血管性癡呆、急性缺血性腦病和中風(fēng)后遺癥，療效顯著[2-4]。本文用小鼠缺血再灌注模型模擬人類腦梗死，觀察抑肝散對(duì)腦缺血的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1藥品和試劑

抑肝散方中各藥材均購(gòu)于南京市金陵大藥房并經(jīng)本校秦民堅(jiān)教授鑒定：當(dāng)歸為Angelica sinensis(Oliv.)Diels的根，鉤藤為Unearia rhynchophy lia(Miq.)Jacks的干燥帶鉤莖枝，川芎為L(zhǎng)igusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖，白術(shù)為Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖，茯苓為Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，柴胡為 Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根，甘草為Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根莖。實(shí)驗(yàn)時(shí)按原方比例稱取藥材，常規(guī)水煎煮，濃縮，用時(shí)加蒸餾水配成所需濃度。實(shí)驗(yàn)中所用劑量均按生藥量計(jì)算。

尼莫地平(Nimodipine，Nim)，天津市中央藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào):090502；無(wú)水乙醇，南京化學(xué)試劑廠產(chǎn)品，批號(hào):080110046；水合氯醛，中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司，批號(hào):20080610；2,3,5-三苯基氯化四氮唑，批號(hào):20100423，Amresco。除尼莫地平之外，以上均為分析純。一氧化氮、一氧化氮合酶（NOS）試劑盒（批號(hào):20100303、20100323）；考馬斯亮蘭測(cè)定試劑盒（批號(hào):20091214），以上購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司)；純水機(jī)(Hi-tech Instruments Co.Ltd)；電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Sigma，美國(guó))；DG3022A型酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)儀(Thermo Electron 公司，美國(guó))；恒溫干燥箱（Ecocell，德國(guó)）；Kubota 5800離心機(jī)（久保田公司，日本）。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)ICR雄性小鼠，江蘇省南京市青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，許可證號(hào)SCXK(蘇)2007.0001，體重18～22 g，動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，保持12 h晝夜節(jié)律，室溫(22±1)℃，自由飲水?dāng)z食。

1.4 分組、給藥及造模

分組及給藥：小鼠隨機(jī)分為6組，每組8只。假手術(shù)組(正常組)；模型組；尼莫地平組(0.6 mg·kg-1)；抑肝散低(3 g·kg-1)、中(6 g·kg-1)、高(12 g·kg-1)劑量組。給藥7 d末次給藥1 h后手術(shù)，模型組及假手術(shù)組灌胃相同容積水。

局灶性腦缺血/再灌注模型的制備[5]：將小鼠用4%水合氯醛(350 mg·kg-1)麻醉后，仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒，頸正中切口，分離暴露右側(cè)頸部血管，將頸外動(dòng)脈(ECA)、頸總動(dòng)脈(CCA)結(jié)扎，頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)輕微系扎。在頸總動(dòng)脈上做一切口，將制作好的魚線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，繼續(xù)進(jìn)線直到略感阻力為止。此時(shí)，魚線前端已經(jīng)阻斷大腦中動(dòng)脈(MCA)起始段及其所有血液供應(yīng)，造成 MCA局灶性缺血，縫合皮膚。經(jīng)過1 h的梗塞后，輕輕地將魚線拉出 MCA起始段，進(jìn)行再灌注，放回籠中保溫飼養(yǎng),1 h后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。假手術(shù)組的麻醉及手術(shù)過程與模型組相同，但不阻斷頸總動(dòng)脈，觀察時(shí)間與模型組相同。在全部造模過程中保持動(dòng)物肛溫在37℃左右。

1.5 神經(jīng)功能缺陷評(píng)分

整個(gè)評(píng)分采用單盲法，即評(píng)分者不知道實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組情況。采用Longa[6]的5分評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分為無(wú)癥狀；1分為不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分為向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分為向?qū)?cè)傾倒；4分為不能自行行走，意識(shí)喪失。剔除0分、4分和術(shù)后死亡動(dòng)物，滿足1、2、3分的動(dòng)物均為造模成功。

1.6 腦含水量、腦指數(shù)及腦梗死率的測(cè)定[7]

小鼠腦缺血再灌注24 h后斷頭取腦，去小腦及延腦。稱重(濕腦重)，計(jì)算腦指數(shù)(腦指數(shù)=濕腦重×100/體重)。然后在110℃烤箱中烤至恒重，分析天平稱重(干腦重)，計(jì)算腦含水量，腦含水量（%）=(濕腦重-干腦重)/濕腦重×100%。

另一部分小鼠腦去除嗅腦、小腦和低位腦干，取左側(cè)大腦半球沿冠狀面切成5片，進(jìn)行TTC染色，置37℃溫育10 min后，正常組織呈紅色，梗死組織呈白色。小心挖取并稱重白色組織，以梗塞組織重量占全腦重量百分比為腦梗死率。

1.7 組織病理檢查

小鼠腦缺血再灌注24 h后斷頭取腦，去小腦及延腦。在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干。甲醛固定，冠狀面切為三部分，常規(guī)包埋，各組取相同部位制成連續(xù)切片。切片厚5 μm，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.8 腦組織中NO、總NOS、iNOS含量的測(cè)定

小鼠斷頭取腦，去除嗅腦、腦干、小腦后將大腦分別置于勻漿器中，用冰生理鹽水按質(zhì)量與體積為1∶9的比例，冰浴下制備成體積分?jǐn)?shù)為10%的腦組織勻漿,2500 r·min-1，離心 15 min，取上清液備用。按照試劑盒說明書測(cè)定腦組織中NO、總NOS、iNOS含量。蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 抑肝散對(duì)腦缺血/再灌注小鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分的影響

腦缺血再灌注1 h后,除正常組之外所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均出現(xiàn)了不同程度的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能障礙，抑肝散各劑量組動(dòng)物的神經(jīng)功能缺陷評(píng)分均呈下降趨勢(shì)，肌力明顯增加，中、高劑量組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表 1。

2.2 抑肝散對(duì)腦缺血再灌注小鼠腦梗死率的影響

小鼠缺血再灌注后經(jīng)TTC染色后，假手術(shù)組腦片全紅；模型組小鼠缺血側(cè)額、頂葉皮質(zhì)及紋狀體可見明顯的白色梗死灶，其梗死率為21.45%；抑肝散低、中、高各劑量組小鼠腦梗死率明顯降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表1。

表1 抑肝散對(duì)腦缺血/再灌注小鼠在神經(jīng)功能缺陷評(píng)分和梗死率的影響(±s，n=8)

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 模型組

2.3 抑肝散對(duì)腦缺血/再灌注小鼠腦組織病理改變的影響

HE染色后可見模型組大腦皮層灰質(zhì)細(xì)胞層次紊亂，大部分神經(jīng)細(xì)胞受壓，體積縮小，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核固縮，核染色深(神經(jīng)細(xì)胞萎縮)，細(xì)胞及毛細(xì)血管間隙明顯增寬，小動(dòng)脈擴(kuò)張充血，間質(zhì)明顯水腫，呈網(wǎng)格狀，與正常組有明顯的形態(tài)差異；而抑肝散中、高劑量組和陽(yáng)性藥組可以明顯改善由腦缺血引起的病理學(xué)改變。結(jié)果見圖1。

圖1 抑肝散對(duì)小鼠腦缺血/再灌注的腦細(xì)胞病理學(xué)改變

2.4 抑肝散對(duì)腦缺血/再灌注小鼠腦含水量和腦指數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)表明，模型組腦含水量及腦指數(shù)與假手術(shù)對(duì)照組比較均明顯增加。而抑肝散中、高劑量組和尼莫地平組能明顯降低腦含水量，抑肝散中、高劑量組及尼莫地平組腦指數(shù)較模型組明顯降低。見表2。

表2 抑肝散對(duì)腦缺血/再灌注小鼠腦含水量和腦指數(shù)的影響(±s，n=8)

表2 抑肝散對(duì)腦缺血/再灌注小鼠腦含水量和腦指數(shù)的影響(±s，n=8)

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs模型組

組別

2.5 抑肝散對(duì)腦缺血/再灌注小鼠腦內(nèi)NO、總NOS、iNOS含量的影響

NO、總NOS、iNOS含量測(cè)試結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組的含量有明顯的升高，除抑肝散低劑量組外各給藥組均能明顯降低模型小鼠腦組織中NO、總NOS、iNOS的含量。 見表3。

表3 抑肝散對(duì)腦缺血/再灌注小鼠NO、總NOS、iNOS含量的影響(±s，n=8)

表3 抑肝散對(duì)腦缺血/再灌注小鼠NO、總NOS、iNOS含量的影響(±s，n=8)

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 模型組

3 討 論

缺血性腦血管疾病的發(fā)病率、致殘率和病死率均較高，一般以局灶性腦缺血為主，其中大腦中動(dòng)脈栓塞造成的腦梗死最為多見。本實(shí)驗(yàn)以此為依據(jù)，研究抑肝散對(duì)小鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型的影響。結(jié)果顯示，抑肝散給藥組小鼠的神經(jīng)行為學(xué)缺陷明顯改善，腦梗死率和腦含水量明顯降低。腦組織病理學(xué)檢查表明，抑肝散可顯著改善因缺血再灌注引起的神經(jīng)細(xì)胞萎縮、細(xì)胞及毛細(xì)血管間隙的增寬和小動(dòng)脈的擴(kuò)張充血，表明抑肝散對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。

缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中，NO具有非常復(fù)雜的雙重作用,在腦缺血早期，NO的產(chǎn)生具有神經(jīng)保護(hù)作用，松弛血管平滑肌，抑制血小板和白細(xì)胞的聚集與粘附，調(diào)節(jié)腦血流量，參與學(xué)習(xí)記憶過程[8]。隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，尤其是進(jìn)入再灌注期，由于能量代謝衰竭，可致離子泵功能障礙，興奮性氨基酸釋放大量鈣離子內(nèi)流，產(chǎn)生大量的NO，過量的NO可通過激活鳥苷酸環(huán)化酶而使cGMP水平升高、擴(kuò)張腦血管、增加腦水腫，高濃度NO可抑制各種線粒體電荷傳遞系統(tǒng)的酶，抑制細(xì)胞呼吸和能量代謝，并且通過氧化應(yīng)激反應(yīng)生成大量活性氧物質(zhì)和過氧亞硝酸鹽，引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷壞死，脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致高蛋白水腫液的滲出和表面活性物質(zhì)的失活，從而造成不可逆神經(jīng)元細(xì)胞的損傷。NOS是NO合成過程中重要的限速因素，體內(nèi)NO的生物作用完全依賴NOS的活性。因此，測(cè)定NOS是研究NO生理病理作用的重要環(huán)節(jié)，目前已經(jīng)確定的NOS亞型主要有神經(jīng)元型NOS(nNOS)、內(nèi)皮型NOS(eNOS)和誘生型NOS(iNOS)[9-10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在腦缺血1 h再灌注24 h后腦組織NO、總NOS、iNOS含量顯著升高，抑肝散能明顯降低這3種物質(zhì)的含量，從而減輕NO的神經(jīng)細(xì)胞毒性，有效減輕缺血再灌注損傷。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，抑肝散可能通過降低NO的神經(jīng)毒性而對(duì)缺血再灌注腦損傷發(fā)揮保護(hù)作用,但缺血再灌注腦損傷的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜,各種因素間可能相互促進(jìn)、相互影響。 抑肝散究竟是通過直接還是間接途徑降低NO的神經(jīng)毒性,值得進(jìn)一步探討。

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