張海元,張 靜 (長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖北荊州434023)

劉康兵 (石首市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科,湖北石首434400)

藥物SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid)是廣譜型組蛋白去乙酰化酶抑制劑 (HDACI),對組蛋白去乙?；?(HDAC)有明顯的抑制作用,能通過細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)分化和凋亡等機(jī)制抑制肝癌細(xì)胞生長。順鉑 (cisplatin,DDP)是臨床應(yīng)用最為廣泛的一種抗癌藥物,鉑類藥物的主要作用機(jī)制是通過損傷DNA,使細(xì)胞進(jìn)入G1期生長抑制,并誘導(dǎo)損傷嚴(yán)重的細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)[1]。但順鉑副作用較大,順鉑用量增大容易引起骨髓抑制及腎功能嚴(yán)重?fù)p害,另外順鉑使用劑量趨近于亞致死劑量時(shí)易引起耐藥性,使得順鉑應(yīng)用于肝細(xì)胞癌的治療效果并不理想,故減少順鉑的使用劑量、增強(qiáng)順鉑抗腫瘤細(xì)胞活性顯得十分重要。通過本項(xiàng)目的組蛋白去乙酰化酶抑制劑藥物SAHA與低劑量順鉑聯(lián)合應(yīng)用對增強(qiáng)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡作用及機(jī)制的探討,有望獲得全新的聯(lián)合抗肝癌的藥物治療方案。

1 材料與方法

1.1 材料

肝癌細(xì)胞HepG2由武漢大學(xué)饋贈,細(xì)胞接種于含10%新鮮牛血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng),DMEM培養(yǎng)液及二甲亞砜 (DMSO)購自美國GIBCO公司。DDP購于錦州九泰藥業(yè)公司,去組蛋白乙酰酶抑制劑SAHA由英國阿斯利康公司提供。

1.2 方法

1.2.1 HepG2細(xì)胞培養(yǎng) 將肝癌細(xì)胞HepG2接種于含10%新生牛血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基中,置于5%CO2及飽和濕度的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。利用0.125%的胰蛋白酶消化傳代,1～2d換液一次。

1.2.2 顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 將細(xì)胞HepG2接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板,設(shè)對照組、SAHA(2.5μ mol/L)組、DDP(6.25μ g/ml)組及SAHA+DDP聯(lián)合治療組。待細(xì)胞貼壁后分別加藥處理,每相隔6h,利用相差倒置顯微鏡觀察各組培養(yǎng)孔內(nèi)細(xì)胞貼壁生長及形態(tài)的變化情況。

1.2.3 MT T法檢測肝癌細(xì)胞 HepG2的增殖情況 將細(xì)胞接種于 96孔板,設(shè)對照組、SAHA(2.5μ mol/L)組、DDP(6.25μ g/ml)組及 SAHA+DDP聯(lián)合治療組,每孔加入 MTT 液 20μ l,于37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h,棄培養(yǎng)液,各孔加200μ l二甲基亞楓,用酶聯(lián)儀在570nm波長下檢測每孔的吸光值,每組重復(fù)3板,計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。細(xì)胞生長抑制率 (%)=[(1—實(shí)驗(yàn)組OD值)/對照組OD值]×100%。

1.2.4 FCM檢測肝癌細(xì)胞 HepG2的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況 HepG2細(xì)胞經(jīng)單純加入 DDP(6.25 μ g/ml)或SAHA(2.5μ mol/L)后48h及SAHA與DDP聯(lián)合應(yīng)用后48h,收集所有貼壁和懸浮細(xì)胞,用10mmol/L PBS(pH 7.4)洗滌兩次,通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

利用相差倒置顯微鏡觀察顯示,對照組中HepG2細(xì)胞呈梭形,扁平上皮細(xì)胞樣,貼壁緊密生長,胞體大,增殖旺盛;DDP組細(xì)胞數(shù)減少,貼壁能力下降,部分細(xì)胞呈現(xiàn)腫大的壞死形狀特征;SAHA組細(xì)胞皺縮為圓形,細(xì)胞數(shù)減少,貼壁能力下降;聯(lián)合治療組細(xì)胞數(shù)明顯減少,部分細(xì)胞皺縮為圓形,貼壁能力明顯下降,細(xì)胞間距變大,大多數(shù)細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)液中。

2.2 肝癌細(xì)胞HepG2的生長抑制率

檢測結(jié)果顯示,2.5μ mol/L SAHA與6.25μ g/ml DDP聯(lián)合應(yīng)用120h后,HepG2細(xì)胞增殖抑制率達(dá)(95.47±2.38)%,顯著高于僅用SAHA組 (49.36±1.73)及DDP組 (42.52±1.35)%(均P＜0.05),見表1。

表1 各組藥物對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用 %

2.3 HepG2細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率變化

2.5μ mol/L SAHA可導(dǎo)致HepG2細(xì)胞S期減少、G2/M 期阻滯,而 SAHA與6.25μ g/ml DDP聯(lián)用后,對HepG2細(xì)胞的S期減少、G2/M 期阻滯更明顯。當(dāng)2.5μ mol/L SAHA與 6.25μ g/ml DDP聯(lián)用60h后,HepG2細(xì)胞凋亡率達(dá) (16.26±1.29)%,明顯高于單用SAHA組 (9.25±0.81)%和DDP組 (5.48±0.19)%(均 P＜0.05),見表 2。

表2 各組藥物對HLE細(xì)胞周期及凋亡的影響 %

3 討 論

肝細(xì)胞癌是常見的消化道惡性腫瘤,肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展不僅存在細(xì)胞增殖與分化的異常,也與細(xì)胞凋亡異常密切相關(guān)[2]。近年來,抑制組蛋白去乙?；赋蔀榭鼓[瘤細(xì)胞活性的一種方法,大量研究證明HDAC抑制劑有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖阻滯、分化和凋亡以及選擇性地作用腫瘤細(xì)胞等抗癌活性[3]。HDAC抑制劑通過抑制HDACs并增強(qiáng)特定蛋白的乙酰化而逆轉(zhuǎn)變異細(xì)胞表型,為惡性腫瘤的治療開拓了新的思路。目前已有多種HDAC抑制劑進(jìn)入了臨床Ⅰ期和Ⅱ期試驗(yàn),包括MS-275、SAHA、TSA等,已被證實(shí)對白血病和實(shí)體瘤表現(xiàn)出良好的療效,不良反應(yīng)的發(fā)生率及發(fā)生程度均極低,這說明與傳統(tǒng)的化療藥物相比HDACI具有較大的優(yōu)勢[4]。但鑒于HDACI抗腫瘤活性具有可逆性,另外HDACI在治療腫瘤時(shí)毒副作用尚可接受,但長期應(yīng)用應(yīng)考慮其毒副作用,故建立HDACI與化療藥物聯(lián)合治療有望增加療效。組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA是一種新型的廣譜類藥物,能使HDAC1和HDAC2底物的組蛋白H3乙酰化明顯增強(qiáng),對HDAC有明顯的抑制作用。SAHA通過抑制HDAC活性,誘導(dǎo)靶細(xì)胞中組蛋白高度乙?；?從而改變組蛋白與DNA鏈間結(jié)合狀態(tài),有利于轉(zhuǎn)錄因子與DNA鏈結(jié)合,啟動特異性基因表達(dá),從而達(dá)到阻斷腫瘤細(xì)胞生長的作用[5]。組蛋白去乙?；敢种苿┧幬颯AHA在體外能有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,在體內(nèi)可以抑制實(shí)體瘤的生長,并能有效抑制腫瘤血管的形成[6]。SAHA能特異性殺傷腫瘤細(xì)胞,對正常細(xì)胞影響較小[7]。據(jù)報(bào)道,Suzuki等[8]應(yīng)用SAHA聯(lián)合順鉑治療口腔鱗狀細(xì)胞癌,發(fā)現(xiàn)SAHA明顯增強(qiáng)了順鉑的細(xì)胞毒性作用,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)通過MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測到了SAHA與化療藥物DDP單用或聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對肝癌細(xì)胞HepG2增殖的抑制作用。MT T檢查結(jié)果顯示,2.5μ mol/L SAHA與6.25μ g/ml DDP聯(lián)合應(yīng)用后5d,HepG2細(xì)胞增殖抑制率達(dá) (95.47±2.38)%,顯著高于單用SAHA組的 (49.36±1.73)%和DDP組的 (42.52±1.35)%(均P＜0.05),說明苯酰胺類組蛋白去乙酰酶抑制劑SAHA與低劑量化療藥物順鉑聯(lián)合應(yīng)用后,能明顯誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞增殖抑制。FCM結(jié)果顯示,SAHA與DDP聯(lián)合應(yīng)用明顯導(dǎo)致細(xì)胞S期減少,G2/M期阻滯;SAHA聯(lián)合DDP組細(xì)胞凋亡率為 (16.26±1.29)%,顯著高于單用SAHA組的 (9.25±0.81)%和DDP組的 (5.48±0.19)%(均P＜0.05),說明SAHA與順鉑聯(lián)合應(yīng)用,可能通過上調(diào)p21基因表達(dá),阻止腫瘤細(xì)胞進(jìn)入S期,使其停滯于G1期,同時(shí)發(fā)生G2/M期阻滯,腫瘤細(xì)胞凋亡率明顯增強(qiáng)。由本實(shí)驗(yàn)推測,SAHA與DDP聯(lián)合應(yīng)用時(shí)其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與細(xì)胞周期阻滯及上調(diào)凋亡作用有關(guān)。因此,SAHA與化療藥物DDP在肝細(xì)胞癌的治療上有一定的互補(bǔ)作用,能提高抗肝細(xì)胞癌的療效,并通過降低化療藥物的用量,減少其毒副作用及耐藥性。

HDACIs類藥物和化療藥物合用已經(jīng)成為最近腫瘤治療界的研究熱點(diǎn),該研究的方向是通過HDACIs類藥物增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物順鉑的敏感性起到增效的目的。通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SAHA與順鉑聯(lián)合應(yīng)用明顯優(yōu)于單獨(dú)用藥組,其作用機(jī)制除了通過增強(qiáng)促進(jìn)HepG2細(xì)胞周期阻滯和凋亡作用外,可能還與HDACIs類藥物本身特性有關(guān)。HDACIs類藥物能導(dǎo)致組蛋白乙酰化,使染色質(zhì)處在一種開放的構(gòu)象上,會促使順鉑等以DNA為作用靶點(diǎn)的化療藥物更易接近核小體之間的DNA連接區(qū),從而更易發(fā)揮作用[9]。本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用SAHA及化療藥物順鉑處理肝癌細(xì)胞,為肝細(xì)胞癌的治療提供新的靶點(diǎn)和全新的聯(lián)合用藥方案。

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