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乳源β-酪啡肽-7對高血糖大鼠小腸黏膜氧化應(yīng)激的影響

印 虹，馬 暢，韓東寧，張?jiān)词?

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部生理生化重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

為了探討主要的乳源活性肽β-酪啡肽-7對高血糖大鼠小腸黏膜氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。本研究選用SD雄性大鼠43只，隨機(jī)取35只誘導(dǎo)高血糖模型，另8只作為空白對照。造模成功大鼠24只隨機(jī)分為高、低劑量組和模型對照組。高、低劑量組每12h灌胃β-CM-7溶液1mL，高劑量組β-CM-7濃度為7.5×10-6mol/L，低劑量組β-CM-7濃度為7.5×10-7mol/L，模型對照組、空白對照組大鼠按等體積蒸餾水灌胃。連續(xù)灌胃30d后，斷頸處死，取血漿、小腸黏膜等進(jìn)行小腸黏膜Na+-K+-ATP酶、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)活性與丙二醛含量測定。結(jié)果表明：低劑量組能顯著提高高血糖大鼠小腸黏膜Na+-K+-ATP酶活力及CAT活力(P＜0.05)；高、低劑量組均能顯著提高高血糖大鼠小腸黏膜SOD、GSH-Px酶活力(P＜0.05)；低劑量組能顯著降低高血糖大鼠小腸黏膜MDA含量。結(jié)論：β-CM-7可以通過上調(diào)小腸黏膜SOD、GSH-Px等抗氧化應(yīng)激酶活性，緩解高血糖氧化應(yīng)激產(chǎn)生的自由基對機(jī)體小腸黏膜的損傷。

高血糖；小腸黏膜；Na+-K+-ATP酶；氧化應(yīng)激

糖尿病是威脅人類健康的三大殺手之一。近年來發(fā)現(xiàn)糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生與機(jī)體的氧化應(yīng)激增加有關(guān)。許多研究表明，糖尿病的高血糖等因素使大鼠氧自由基大量產(chǎn)生，且清除氧自由基的酶 SOD、GSH-Px等因非酶性糖基化反應(yīng)而活性降低，對自由基的清除減少，兩者共同導(dǎo)致氧化應(yīng)激加重。氧化應(yīng)激損害胰島素合成和分泌，損害肌肉、脂肪和肝臟等組織細(xì)胞正常生理功能，使得血糖持續(xù)升高，促進(jìn)了糖尿病的發(fā)生和發(fā)展[1]，氧化應(yīng)激已經(jīng)成為糖尿病發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要原因[2]。預(yù)防和抵抗糖尿病及其并發(fā)癥的關(guān)鍵不僅要控制血糖，抗氧化劑用于糖尿病的治療也已經(jīng)開始起步。

β-酪啡肽-7(β-CM-7)是由酪蛋白酶解產(chǎn)生的最具代表性的一種乳源生物活性肽，由7個(gè)氨基酸組成。研究發(fā)現(xiàn)β-CM-7具有多種生物學(xué)功能，如促進(jìn)仔豬小腸絨毛的生長[3]；提高斷奶仔豬胃腸道細(xì)胞免疫和黏膜免疫活性[4]；下調(diào)小腸黏膜鈉葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)載體(SGLT-1)、葡萄糖協(xié)助擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)載體(GLUT-2)mRNA的轉(zhuǎn)錄，減少大鼠小腸對葡萄糖的吸收[5]等。宗亞鋒[6]的研究證實(shí)β-CM-7能夠抑制小腸葡萄糖的吸收，有輔助降血糖作用。也有研究從酪蛋白的胃蛋白酶酶解物中分離并鑒定了具有自由基清除活性的肽[7]。β-CM-7對于小腸黏膜抗氧化應(yīng)激的研究卻未見報(bào)道。

本研究擬以鏈脲佐菌素誘導(dǎo)大鼠高血糖模型，結(jié)合小腸黏膜MDA、SOD、GSH-Px等指標(biāo)的變化，探討β-CM-7對糖尿病持續(xù)高血糖大鼠小腸黏膜抗氧化應(yīng)激的作用，為挖掘β-CM-7對于糖尿病治療的潛在價(jià)值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

SD大鼠，雄性，購自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)：SCXK(浙)2008-0033)；標(biāo)準(zhǔn)鼠糧購于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司；大鼠飼養(yǎng)于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生理生化重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房。

鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)、β-酪啡肽-7 (β-Casomorphin-7，β-CM-7) 美國Sigma公司；Na+-K+-ATP酶、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；STZ用0.1mol/L、pH4.2 的檸檬酸鈉緩沖液溶解，配成4mg/mL的溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

怡成血糖儀、怡成虹吸式血糖試紙 北京怡成生物電子有限公司。

1.2 方法

1.2.1 STZ 致高血糖模型的建立

參照余傳林[8]的方法。SD大鼠43只，雄性，體質(zhì)量120～140g，隨機(jī)取其中35只作為高血糖模型組，另8只作為空白對照組。給藥前大鼠禁食、過夜，高血糖模型組大鼠按60mg/kg(以體質(zhì)量計(jì))一次性腹腔注射STZ溶液，另8只對照組大鼠按同樣方法腹腔注射等體積生理鹽水。給藥后大鼠自由采食與飲水，觀察并記錄攝食與飲水的變化。

分別于注射STZ后24、72h剪尾取血，用血糖儀測定所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的空腹(禁食8h)血糖。以空腹條件下血糖值≥14mmol/L為高血糖造模成功。

1.2.2 動(dòng)物分組和樣品采集

取造模成功大鼠24只隨機(jī)分為β-CM-7高劑量組(7.5× 10-6mol/L)，β-CM-7 低劑量組(7.5×10-7mol/L)和β-CM-7模型對照組(0mol/L)。每12h灌胃β-CM-7溶液1mL，模型對照組和空白對照組大鼠按等體積蒸餾水灌胃。30d后，斷頸處死所有大鼠，取血漿、小腸黏膜等組織，-70℃保存。

1.2.3 小腸黏膜Na+-K+-ATP酶活力測定

將刮取的腸囊黏膜按照試劑盒說明書檢測其Na+-K+-ATP酶活力。

樣本前處理：準(zhǔn)確稱取腸黏膜組織50mg加入生理鹽水450μL制成10%的勻漿，3500r/min離心10min，取上清液再用生理鹽水按1:4稀釋成2%的勻漿待測。Na+-K+-ATP酶活力測定按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 小腸黏膜SOD、GSH-Px、CAT酶活力以及MDA含量的測定

按試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 β-CM-7對大鼠小腸黏膜Na+-K+-ATP酶活力的影響

圖1 β-CM-7對大鼠大腸黏膜Na+-K+-ATP酶活力的影響(n=8)Fig.1 Effect of β-casomorphin -7 on the activity of Na+-K+-ATPase in small intestine mucosa (n=8)

由圖1可知，模型對照組大鼠小腸黏膜Na+-K+-ATP酶活力顯著低于空白對照組(P＜0.05)。而低劑量組大鼠小腸黏膜Na+-K+-ATP酶活力顯著高于模型對照組大鼠(P＜0.05)。

2.2 β-CM-7對大鼠小腸黏膜MDA含量的影響

MDA是機(jī)體氧化應(yīng)激的重要標(biāo)志物之一。由表1可知，模型對照組大鼠小腸黏膜MDA含量顯著高于空白對照組大鼠(P＜0.05)；低劑量組大鼠小腸黏膜MDA含量要顯著低于模型對照組大鼠(P＜0.05)。

表1 大鼠小腸黏膜SOD、GSH-Px、CAT活力以及MDA含量(n=8)Table 1 Activities of SOD, GSH-Px and catalase and the levels of MDA in small intestine mucosa in control and treatment groups of rats (n = 8)

2.3 β-CM-7對大鼠小腸黏膜SOD、GSH-Px、CAT活力的影響

由表1可知，模型對照組大鼠小腸黏膜SOD、GSH-Px活力顯著低于空白對照組大鼠(P＜0.05)。而高劑量組大鼠小腸黏膜SOD、GSH-Px活力均顯著高于模型對照組大鼠(P＜0.05)，低劑量組大鼠小腸黏膜SOD、GSH-Px、CAT活力均顯著高于模型對照組大鼠(P＜0.05)。

3 討 論

STZ被廣泛用于實(shí)驗(yàn)糖尿病大鼠模型的誘導(dǎo)[9]，STZ對胰島β細(xì)胞有特異的毒力作用，其機(jī)制[10-11]是其對DNA的烷基化，繼而激活了DNA聚合酶的切除修復(fù)途徑?；罨腄NA聚合酶使得胰島NAD+耗竭，加劇了胰島β細(xì)胞的凋亡。STZ誘導(dǎo)的動(dòng)物模型是Ⅰ型糖尿病，表現(xiàn)為胰島素的缺乏、高血糖特征。本實(shí)驗(yàn)采用STZ腹腔注射誘導(dǎo)的35只大鼠中，有24只空腹血糖穩(wěn)定維持在14mmol/L以上，表明本實(shí)驗(yàn)STZ誘導(dǎo)高血糖大鼠模型成功。

機(jī)體在高血糖的狀況下代謝紊亂，自由基的產(chǎn)生加劇，自由基的清除處于失衡狀態(tài)，因此機(jī)體處于氧化應(yīng)激的狀態(tài)[1]。MDA是公認(rèn)的氧化應(yīng)激的標(biāo)志物之一[12]。本實(shí)驗(yàn)中模型對照組大鼠小腸黏膜MDA含量顯著高于空白對照組大鼠(P＜0.05)，提示高血糖時(shí)小腸黏膜與大量文獻(xiàn)[1-2,13]報(bào)道的肝臟、肌肉等一樣，也處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。低劑量灌胃β-CM-7能顯著降低糖尿病大鼠小腸黏膜的MDA含量(P＜0.05)，表明β-CM-7能減輕糖尿病大鼠小腸黏膜的氧化應(yīng)激水平，對高血糖所致的小腸黏膜損傷有一定的抵抗作用。

機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激[14]主要通過兩個(gè)途徑進(jìn)行。即：1)提高抗氧化應(yīng)激酶的活性，包括SOD、GSH-Px、CAT等；2)通過食物攝入一些抗氧化物質(zhì)，如：VA、VC、VE等。胡文琴等[7]研究發(fā)現(xiàn)，酪蛋白的酶解物具有較強(qiáng)的抗氧化作用，其作用機(jī)制可能與直接清除活性氧、提高SOD活性或是抑制膜性結(jié)構(gòu)上的脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中模型對照組大鼠小腸黏膜SOD等活力的降低，使得小腸黏膜氧化應(yīng)激程度加劇，與文獻(xiàn)[1]報(bào)道結(jié)果一致。高劑量的β-CM-7灌胃能顯著提高糖尿病大鼠小腸黏膜SOD、GSH-Px活力，低劑量的β-CM-7灌胃能顯著提高糖尿病大鼠小腸黏膜SOD、GSH-Px、CAT活力，提示β-CM-7能通過上調(diào)小腸黏膜抗氧化應(yīng)激的酶活力來增強(qiáng)其抗氧化應(yīng)激的能力，等與胡文琴等[7]的研究結(jié)果一致。

小腸黏膜是機(jī)體主要的消化吸收場所。大部分營養(yǎng)物質(zhì)(例如葡萄糖、氨基酸)的吸收是通過小腸黏膜進(jìn)行的[15]，葡萄糖的吸收屬于主動(dòng)運(yùn)輸，需要Na+-K+-ATP酶提供能量。本實(shí)驗(yàn)中模型對照組大鼠小腸黏膜Na+-K+-ATP酶活力與空白對照組相比，顯著降低(P＜0.05)，灌胃酪啡肽后Na+-K+-ATP酶活力高于模型對照組。Maeda等[12]報(bào)道機(jī)體或組織若處于氧化應(yīng)激的狀態(tài)，過多的自由基會(huì)進(jìn)攻酶的活性中心，使得一些重要的酶或者蛋白質(zhì)失去其生理學(xué)功能。本實(shí)驗(yàn)中模型對照組小腸黏膜中Na+-K+-ATP酶活力下降，推測其與小腸黏膜處于氧化應(yīng)激的狀態(tài)有關(guān)。

綜上所述，持續(xù)高血糖可以引起小腸黏膜處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，β-CM-7可以通過顯著上調(diào)小腸黏膜SOD、GSH-Px等抗氧化應(yīng)激酶的活性，提高小腸黏膜Na+-K+-ATP酶活力，增強(qiáng)小腸黏膜抗氧化應(yīng)激的能力，緩解高血糖氧化應(yīng)激產(chǎn)生的自由基對小腸黏膜的損傷，即β-CM-7對糖尿病大鼠小腸黏膜有一定的保護(hù)作用。

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Effects of β-CM-7 on the Oxidative Stress of Small Intestine Mucosa in Diabetic Rats

YIN Hong，MA Chang，HAN Dong-ning，ZHANG Yuan-shu*
(Key Laboratory of Animal Physiology and Biochemistry, Ministry of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The present study was aimed to investigate the possible protective effects of β-casomorphin -7 in small intestine mucosa in diabetic rats. A total of 43 male SD rats were used for this stud and were divided into two groups of control (n = 8) and hyperglycemia group (n = 35). The hyperglycemia rats (n = 24) were randomly divided into three groups: positive control rats, high dose β-CM-7 treated diabetic rats, and low dose β-CM-7 treated diabetic rats. On the last day of treatment, the animals were deprived of food overnight and sacrificed by cervical dislocation. Blood was collected at the presence of anticoagulant and the small intestine mucosa was obtained. The MDA level and the activity of Na+-K+-ATPase, SOD, GSH-Px, and CAT of small intestine mucosa were measured. The results showed after 30 days oral administration of β-casomorphin -7, the activity of Na+-K+-ATPase was markedly increased compared with positive control rats. Oral administration of high or low does of β-CM-7 to diabetic rats showed an increase in the activity of SOD, and GSH-Px, and low does also showed the reducing function on the elevated MDA level in diabetic rats. Thus the results of the present study suggest that β-casomorphin -7 can decrease the oxidative stress in small intestine mucosa in diabetic rats by elevating the activity of enzymatic antioxidants including SOD and GSH-Px.

hyperglycemia；small intestine mucosa；Na+-K+-ATPase；oxidative stress

S858

A

1002-6630(2011)03-0208-04

2010-05-24

印虹(1984—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘钚噪?。E-mail：2008107031@njau.edu.cn

*通信作者：張?jiān)词?1962—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)樯锘钚噪摹-mail：zhangyuanshu@njau.edu.cn