周曉玲 謝 勝 侯秋科

廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)院（廣西柳州545001）

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是一種肝組織學(xué)改變，與酒精性肝?。ˋLD）相類(lèi)似，但無(wú)過(guò)量飲酒史的臨床病理綜合征。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)通過(guò)中醫(yī)外治穴位埋線(xiàn)的方法對(duì)治療NAFLD效果明顯。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察穴位埋線(xiàn)對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠NAFLD及其膽固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白-1（SREBP-1）的影響，以探討穴位埋線(xiàn)對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠NAFLD作用及其可能機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性wistar大鼠40只，清潔級(jí)，體質(zhì)量170～200g，由廣西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)室室溫 （20±3）℃，分籠喂養(yǎng)。

1．2 試藥及儀器 肝組織總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）試劑盒為北京福瑞生物工程公司產(chǎn)品。一抗兔抗大鼠SREBP-1多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）。二抗羊抗兔IgG-HRP由武漢博士德公司提供。膽固醇及0．3%膽酸鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。豬油為市售。普通飼料和高脂飼料（含87．7%普通飼料+2%膽固醇+0．3%膽酸鈉+10%豬油）均購(gòu)自廣西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（桂檢證字2003A010號(hào)）。超敏發(fā)光液由北京普利萊公司提供。

1．3 分組及造模 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組、模型組、穴位埋線(xiàn)4周組、穴位埋線(xiàn)8周組，每組8只。模型組、穴位埋線(xiàn)4周組、穴位埋線(xiàn)8周組給予高脂飼料飲食，正常對(duì)照組給予普通飼料飲食，自由飲水。

1．4 穴位埋線(xiàn)治療方法 根據(jù)化痰利濕、活血化瘀的治則，穴位埋線(xiàn)治療組取豐隆、足三里、太沖、三陰交穴［1］。將大鼠置于自制固定器中，取雙側(cè)上述穴位，線(xiàn)穿進(jìn)3號(hào)注射針頭內(nèi)，將針頭刺入穴位，直刺約5mm，提插得氣后，用針芯抵住羊腸線(xiàn)（針芯由直徑0．1mm、長(zhǎng)5mm毫針剪成平頭改成），緩緩?fù)顺鲠樄?，將羊腸線(xiàn)留在穴內(nèi)。每3日1次，穴位埋線(xiàn)4周組治療4周，穴位埋線(xiàn)8周組治療8周。模型組大鼠亦置入固定器中15min，但不進(jìn)行治療。

1．5 標(biāo)本采集 每組大鼠在治療結(jié)束后隔夜禁食12h，稱(chēng)體質(zhì)量，以10%水合氯醛1mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，開(kāi)腹后肉眼觀察肝臟情況，腹主動(dòng)脈取血，0．5h內(nèi)離心取血清待檢。取肝左葉同一部位1cm×1cm×1cm組織置于細(xì)胞裂解液中，勻漿并收集蛋白，-20℃保存。

1．6 檢測(cè)方法 一般情況：觀察大鼠食欲行為、狀態(tài)、體質(zhì)量、毛發(fā)及死亡情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)束測(cè)體質(zhì)量及肝濕質(zhì)量。血清指標(biāo)測(cè)定：測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、TG、TC，全部采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)。Western Blot檢測(cè)肝組織蛋白SREBP-1的表達(dá)：肝左葉同一部位每100mg組織加入400μL MPER蛋白提取試劑，在冰上充分勻漿后，收集勻漿液，10000r/min離心5min，轉(zhuǎn)移上清。分裝后，取50μL，加入6×蛋白質(zhì)樣品緩沖液10μL混勻，在100℃水浴中煮沸5min，各組取10μL在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，TTBS洗5min，3次，5%脫脂牛奶封閉30min，分別加兔抗ALP和VDR多克隆抗體（1∶1000）。4℃過(guò)夜，TTBS洗 5min，4次，分別與 HRP 標(biāo)記的二抗羊抗兔IgG （1∶10000）室溫下振蕩孵育 1h，TTBS洗10min，4次，加超敏發(fā)光液反應(yīng)5min，在暗室中曝光，后在顯影液和定影液中沖洗膠片，顯像后觀察結(jié)果。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，計(jì)數(shù)資料比較采用檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 各組一般情況比較 見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，穴位埋線(xiàn)4周組大鼠于第6周因肺部感染死亡1只。穴位埋線(xiàn)4周組其余大鼠和其余組大鼠生長(zhǎng)發(fā)育良好，無(wú)死亡。與正常對(duì)照相比較，模型組大鼠肝臟濕質(zhì)量和肝指數(shù)（每100g體質(zhì)量的肝臟濕質(zhì)量）均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0．05）。與模型組相比，穴位埋線(xiàn) 4周組、穴位埋線(xiàn)8周組大鼠體質(zhì)量、肝臟濕質(zhì)量均較模型組有所下降，其中穴位埋線(xiàn)8周組肝指數(shù)與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

2．2 各組血清學(xué)指標(biāo)比較 見(jiàn)表2。模型組大鼠血清ALT、AST較正常對(duì)照組大鼠顯著升高（P＜0．01）；與模型組相比，穴位埋線(xiàn)4周組、穴位埋線(xiàn)8周組大鼠ALT、AST均有下降趨勢(shì)，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0．05）。與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清TC顯著升高（均為P＜0．01），與模型組相比，穴位埋線(xiàn)4周組、穴位埋線(xiàn)8周組血清TG、TC均有下降，其中TC顯著下降（P＜0．01）。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、肝濕質(zhì)量和肝指數(shù)比較 （±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量、肝濕質(zhì)量和肝指數(shù)比較 （±s）

與正常對(duì)照組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組比較，△P ＜0．05，△△P ＜0．01。 下同。

組 別正常對(duì)照組模型組穴位埋線(xiàn)4周組穴位埋線(xiàn)8周組n 8878體質(zhì)量（g）473．54±10．66 480．63±11．26 430．45±12．23△424．08±18．03△肝臟濕質(zhì)量（g） 肝指數(shù)12．98±0．30 2．73±0．06 18．56±0．52* 3．66±0．05*13．89±1．03△ 3．27±0．12 12．98±1．85△ 2．97±0．14△

表2 各組血清學(xué)指標(biāo)比較 （±s）

表2 各組血清學(xué)指標(biāo)比較 （±s）

組 別正常對(duì)照組模型組穴位埋線(xiàn)4周組穴位埋線(xiàn)8周組n 8878 ALT（U/L）70．31±4．62 123．21±8．56**83．12±10．21△69．21±8．21△AST（U/L）185．12±13．65 279．56±10．23**229．21±15．21△195．52±19．12△TG（mmol/L）0．81±0．08 0．51±0．05**0．28±0．06 0．21±0．08 TC（mmol/L）1．59±0．08 3．98±0．23**2．49±0．31△△2．21±0．27△△

2．3 肝臟SREBP-1的表達(dá) 模型組SREBP-1表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，穴位埋線(xiàn)4周組、穴位埋線(xiàn)8周組SREBP-1蛋白的表達(dá)水平均低于模型組，且穴位埋線(xiàn)8周組的蛋白表達(dá)低于穴位埋線(xiàn)4周組。見(jiàn)圖1。

圖1 肝臟SREBP-1蛋白電泳圖

3 討 論

SREBPs是一類(lèi)能與膽固醇調(diào)節(jié)組件1（SRE-1）發(fā)生特異性結(jié)合的蛋白［2］。SREBP-1a主要調(diào)控膽固醇和脂肪酸合酶（如乙酰輔酶A羧化酶）以及TG代謝的低密度脂蛋白受體的基因轉(zhuǎn)錄，SREBP-1c則選擇性調(diào)控脂肪酸、TG以及糖代謝（如葡萄糖激酶）中基因的表達(dá)水平［3］。胰島素和類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子Ⅰ也可以通過(guò)SREBP-1介導(dǎo)LDL-R啟動(dòng)子的激活，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的膽固醇含量［4］。

NAFLD發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，1998年Day和James提出的“二次打擊”學(xué)說(shuō)已成為解釋該病發(fā)生機(jī)制的主要理論［5］。胰島素抵抗（insulin resistance，IR）在NAFLD的形成中發(fā)揮著“一次打擊”的作用，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性。相關(guān)機(jī)制研究表明，胰島素受體底物2（IRS-2）是胰島素在肝中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要介導(dǎo)物，調(diào)控著胰島素敏感性，而核SREBPs能有效地取代和干擾反式作用因子的結(jié)合，來(lái)抑制下游P13K/Akt通路，從而減少糖原合成［6］。因此，SREBPs能直接下調(diào)IRS-2的轉(zhuǎn)錄，從而抑制胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。推測(cè)這種分子機(jī)制解釋了糖原合成向脂質(zhì)合成的轉(zhuǎn)移以及IR的形成，而IR可通過(guò)增加糖酵解而促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的合成，造成肝內(nèi)脂質(zhì)（主要為T(mén)G）蓄積而引起NAFLD。Shimomura等成功建立了SREBP-1c在肝臟過(guò)度表達(dá)的小鼠模型，觀察到這些小鼠出現(xiàn)了脂質(zhì)紊亂、IR和肝脂肪變性［7］。通過(guò)轉(zhuǎn)基因小鼠和基因剔除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)SREBP-1c主要與脂肪酸代謝和糖代謝有關(guān)［8］。

已有研究表明，針刺在治療脂肪肝及肝纖維化方面有一定的效果［9］。穴位埋線(xiàn)的埋線(xiàn)過(guò)程與針刺過(guò)程相似，具有普通針刺療法的作用效果，并具備針刺“靜以留之”的長(zhǎng)期作用，類(lèi)似“埋針”療法。腸線(xiàn)在穴位內(nèi)慢慢軟化、分解、吸收的過(guò)程對(duì)穴位產(chǎn)生一種柔和而持久的刺激，從而達(dá)到慢性疾病長(zhǎng)期治療的目的。我們通過(guò)大量的前期的臨床工作已發(fā)現(xiàn)穴位埋線(xiàn)對(duì)治療非酒精性脂肪肝的治療有效率達(dá)92.50%，可通過(guò)降低血清瘦素水平、改善胰島素抵抗，增加肝細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，從而調(diào)節(jié)血脂代謝，達(dá)到治療NAFLD患者的作用［10］。本實(shí)驗(yàn)顯示，與正常組相比，模型組SREBP-1的表達(dá)明顯高于正常組。本實(shí)驗(yàn)Western blot結(jié)果顯示穴位埋線(xiàn)4周組、穴位埋線(xiàn)8周組的SREBP-1的蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。穴位埋線(xiàn)8周又低于4周治療組。初步證明穴位埋線(xiàn)對(duì)脂質(zhì)代謝具有時(shí)間的量效關(guān)系，同時(shí)也進(jìn)一步證明了穴位埋線(xiàn)療法在調(diào)控胰島素抵抗信號(hào)通路方面具有重要意義。

綜上所述，中醫(yī)認(rèn)為NAFLD的基本病機(jī)是脾腎虧虛，而在此體質(zhì)基礎(chǔ)上形成的痰、濕、瘀等病理產(chǎn)物為本病發(fā)病之關(guān)鍵，因此我們?cè)谶x擇穴位進(jìn)行埋線(xiàn)治療時(shí)遵循化痰利濕、活血化瘀的治則。SREBP-1作為調(diào)控胰島素調(diào)節(jié)通路中一個(gè)必不可少的元素參與脂質(zhì)的合成，通過(guò)穴位埋線(xiàn)治療能減弱SREBP-1的表達(dá)，這也許與NAFLD的脂質(zhì)的合成減少有關(guān)，調(diào)節(jié)SREBP-l表達(dá)可能是治療NAFLD的潛在的靶點(diǎn)。從而這在一定的程度上推斷穴位埋線(xiàn)療法對(duì)調(diào)控胰島素調(diào)節(jié)通路各蛋白分子的表達(dá)有著潛在作用，也為今后進(jìn)一步探討NAFLD中西醫(yī)病機(jī)的相關(guān)性提供可研究的方向。

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