趙 虹，楊子超，張?bào)@宇

小鼠NMNAT1基因的過(guò)表達(dá)和RNAi重組慢病毒的構(gòu)建包裝和檢測(cè)

趙 虹，楊子超，張?bào)@宇

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江哈爾濱150001)

目的:針對(duì)小鼠煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶1(NMNAT1)基因構(gòu)建質(zhì)粒并進(jìn)行慢病毒包裝，同時(shí)檢測(cè)其表達(dá)水平和干擾效率，為進(jìn)一步探討該基因的功能提供研究工具和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:根據(jù)NMNAT1基因信息，用慢病毒載體pLenti6構(gòu)建三種重組質(zhì)粒，分別包含NMNAT1 cDNA全長(zhǎng)、一個(gè)針對(duì)NMNAT1的小干擾序列和一個(gè)用于干擾對(duì)照的陰性序列。把這些質(zhì)粒包裝進(jìn)慢病毒載體，并檢測(cè)病毒滴度，再用慢病毒感染Hela細(xì)胞檢測(cè)NMNAT1表達(dá)量和RNA干擾效率。結(jié)果:測(cè)序結(jié)果證明目的序列正確地插入到載體內(nèi)。通過(guò)qPCR方法鑒定慢病毒包裝成功，病毒滴度均為2×108TU/ml以上。表達(dá)NMNAT1的重組慢病毒感染Hela細(xì)胞，該細(xì)胞能夠高水平表達(dá)NMNAT1蛋白，而攜帶RNAi序列的慢病毒能夠顯著抑制其表達(dá)，干擾效率在70%以上。結(jié)論:針對(duì)NMNAT1的過(guò)表達(dá)和RNAi重組慢病毒制備成功，為進(jìn)一步研究NMNAT1基因的功能和用慢病毒進(jìn)行基因治療提供了良好的研究工具。

慢病毒屬;重組，遺傳;質(zhì)粒;遺傳載體;煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶1;RNA干擾;基因過(guò)表達(dá)

［JZhejiang Univ(Medical Sci)，2011，40(6):622-629.］

煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶NMNAT蛋白(nicotinamide mononucleotide adenylyl transferase)是一類功能尚不完全明確的酶類。該類蛋白質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達(dá)，近年發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病相關(guān)［1-3］。NMNAT1蛋白能夠感受外界壓力如過(guò)度的活性刺激和損傷刺激，保護(hù)神經(jīng)元的完整性，顯示出神經(jīng)保護(hù)作用［4-5］。但迄今為止，有關(guān)NMNAT1功能研究特別是在神經(jīng)發(fā)育中的研究報(bào)道還很少見(jiàn)。而且利用慢病毒載體表達(dá)NMNAT1基因和對(duì)其進(jìn)行RNA干擾尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究首次利用自主設(shè)計(jì)的RNAi序列，構(gòu)建并包裝了針對(duì)NMNAT1的過(guò)表達(dá)和RNA干擾(RNA interference，RNAi)重組慢病毒載體。本研究建立了有效的NMNAT1研究工具，便于利用慢病毒探討NMNAT1的在神經(jīng)發(fā)育中的功能和利用NMNAT1進(jìn)行基因治療。

1 材料和方法

1.1 材料 Hela細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。人胚腎293T細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。慢病毒質(zhì)粒pLenti6購(gòu)自Invitrogen公司;質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自 Qiagen公司;轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen公司;慢病毒包裝混合質(zhì)粒 pLP1、pLP2和包膜質(zhì)粒 pLP/VSVG購(gòu)自Invitrogen公司。小干擾序列和引物由上海生工公司合成。低分子量蛋白Marker、蛋白質(zhì)提取試劑盒等購(gòu)自賽百盛。檢測(cè)用抗體NMNAT1抗體和GAPDH抗體購(gòu)自CST公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠多抗購(gòu)自中杉公司。

1.2 方法

1.2.1 針對(duì)小鼠 NMNAT1的過(guò)表達(dá)和 RNAi慢病毒載體的構(gòu)建 根據(jù)NMNAT1(NM_022787)的基因信息，從本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建的pcDNA3.1-NMNAT1質(zhì)粒中，用雙酶切法把NMNAT1的cDNA片段轉(zhuǎn)接入pLenti6載體，即得到可表達(dá)NMNAT1的質(zhì)粒。在RNA干擾實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)NMNAT1的mRNA序列設(shè)計(jì)一條RNAi序列和一條陰性(scramble)對(duì)照序列，并均通過(guò)BLAST驗(yàn)證。RNAi序列信息如下①scramble:TTCTCCGAACGTGTCACGT;②siRNA:ACGAGTGGATCACCAATGA。根據(jù)上述兩條序列設(shè)計(jì)四條互補(bǔ)的單鏈DNA，設(shè)計(jì)好的序列送上海生工公司合成。

將合成好的單鏈DNA進(jìn)行稀釋和退火，對(duì)空載體pLenti6用HpaⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切;將退火后稀釋產(chǎn)物和回收好的雙酶切載體進(jìn)行連接反應(yīng);再將連接產(chǎn)物經(jīng)過(guò)PCR鑒定后送上海生工公司測(cè)序，確定序列正確后，使用Qiagen質(zhì)粒抽提試劑盒抽提得到不含內(nèi)毒素的質(zhì)粒，然后將其包裝進(jìn)慢病毒載體。

1.2.2 慢病毒的包裝 參照Invitrogen公司的操作手冊(cè)進(jìn)行慢病毒的包裝。培養(yǎng)293T細(xì)胞株作為包裝細(xì)胞，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將2μg pLenti6重組質(zhì)粒與10μg慢病毒包裝質(zhì)粒混合物轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染36 h和48 h后收集上清液，將含有慢病毒顆粒的上清離心，并用孔徑為0.45μm的PVDF濾膜過(guò)濾。過(guò)濾后的溶液用超速離心的方法進(jìn)行濃縮，將待測(cè)的各病毒儲(chǔ)藏液按梯度稀釋分組后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，結(jié)合qPCR測(cè)定病毒滴度。

1.2.3 慢病毒載體的有效性驗(yàn)證 培養(yǎng)Hela細(xì)胞至匯合度為90% ～95%時(shí)，進(jìn)行慢病毒感染實(shí)驗(yàn)。分為4組:A組為空白對(duì)照組;B組為過(guò)表達(dá)慢病毒感染組;C組為過(guò)表達(dá)慢病毒感染后再感染陰性對(duì)照慢病毒組;D組為過(guò)表達(dá)慢病毒感染后再感染干擾慢病毒組。慢病毒感染細(xì)胞后培養(yǎng)96 h收集細(xì)胞的RNA和總蛋白，采用qPCR和Western Blot分別檢測(cè)mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量。

1.2.4 RNA提取和 qPCR 按 Invitrogen公司的RNA-Trizol試劑盒操作指南提取 RNA。qPCR檢測(cè)過(guò)程如下所述:取抽提的RNA 1μg，Oligo d(T)16.5 μg，加 DEPC 處理水至 15 μl，65℃變性5 min，迅速置冰上冷卻。PCR反應(yīng)體系如下:10× PCR 緩沖液2.5μl，MgCl2溶液3 μl，dNTP 混 合 液 3 μl，Taq 聚 合 酶 3 U，SyberGreen終濃度0.25×，20μmol/L的引物0.5 μl，cDNA 或 DNA 1 μl，加水至總體積為25 μl。反應(yīng)條件如下:94℃，4 min;35個(gè) PCR循環(huán):94℃，10 s;57℃，15 s;72℃，20 s;86.5℃，5 s;為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從72℃緩慢加熱到99℃，每5 s升高1℃后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)終產(chǎn)物仍然可以通過(guò)凝膠電泳的方法檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶大小和豐度。qPCR所用引物序列:

NMNAT1:forward，5'-CGCGGTGCAAATA GCTTAC-3'，

NMNAT1:reverse，5'-TATCTTTCGCCCCT TCCTG-3'，

actin:forward，5'-CCCCAATGTATCCGTTG TG-3'，

actin:reverse，5'-CTCAGTGTAGCCCAGG ATGC-3'。

1.2.5 蛋白免疫印跡法(Western Blot) 細(xì)胞經(jīng)病毒感染后吸去培養(yǎng)基，用PBS洗一遍，然后將1×的SDS凝膠樣品緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl pH 6.8，100 mmol/L 巰基乙醇，2%SDS，0.1%溴酚蘭，10%甘油)加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，冰上裂解5 min，收集樣品放于1.5 ml離心管中，100℃變性10 min，用SDS-PAGE凝膠進(jìn)行蛋白電泳再經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育，接著用ECL(enhanced chemicoilluminenscenecs)底物在暗室中曝光膠片，最后掃描膠片保存得到數(shù)據(jù)。掃描照片用軟件Image-Quant 5.0進(jìn)行分析，以光密度值表示各組的蛋白相對(duì)表達(dá)量，其中空白細(xì)胞組的光密度值作為對(duì)照，其它實(shí)驗(yàn)組與其進(jìn)行校正。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究采用SPSS 11.5軟件先進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)結(jié)果有差異時(shí)再用LSD法進(jìn)行兩兩比較分析。P＜0.05被認(rèn)為差異具有顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒質(zhì)粒載體的鑒定結(jié)果 連接轉(zhuǎn)化后的陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒DNA，采用相應(yīng)的鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，過(guò)表達(dá)和RNAi的片段分別為981 bp和342 bp，電泳條帶顯示慢病毒載體構(gòu)建成功(圖1)。pLenti6-NMNAT1、pLenti6-NMNAT1-shRNA和pLenti6-NMNAT1-Scr-shRNA三種慢病毒質(zhì)粒載體測(cè)序結(jié)果表明，重組慢病毒質(zhì)粒載體的插入序列與設(shè)計(jì)序列一致，沒(méi)有堿基缺失或替換等，同樣證明慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 慢病毒的生產(chǎn)和鑒定結(jié)果 pLenti6載體中帶有 GFP標(biāo)記基因，重組慢病毒質(zhì)粒pLenti6-NMNAT1、pLenti6-NMNAT1-shRNA 和pLenti6-NMNAT1-Scr-shRNA分別與慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔锕厕D(zhuǎn)染293T細(xì)胞24 h后綠色熒光強(qiáng)度高，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，表明病毒包裝成功。病毒液過(guò)濾和超速離心機(jī)濃縮后測(cè)定病毒滴度為2×108TU/ml，這一滴度符合后續(xù)感染Hela細(xì)胞系或者原代神經(jīng)元的實(shí)驗(yàn)要求。定量滴度檢測(cè)通過(guò)qPCR方法完成，實(shí)驗(yàn)采用10倍梯度稀釋法進(jìn)行，滴度=IU×計(jì)量孔相對(duì)于第一孔的稀釋倍數(shù)/第一孔加入病毒體積(IU=最后一孔可以通過(guò)qPCR方法檢測(cè)到NMNAT1基因表達(dá)的細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)中設(shè)為1)。qPCR的結(jié)果見(jiàn)圖2和表1。NMNAT1的擴(kuò)增Ct值見(jiàn)圖2A，擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖 2B;圖2C和圖2D分別為NMNAT1和內(nèi)參基因Actin的熔解曲線。因?yàn)槿劢馇€均為單一峰，無(wú)非特異熒光，故根據(jù)圖2A所得Ct值可準(zhǔn)確定量。通過(guò)以上方法測(cè)定顯示，純化得到的病毒滴度大于2×108TU/ml。采用熒光計(jì)數(shù)的方法，可以檢測(cè)得到RNA干擾慢病毒的滴度大于2×108TU/ml，病毒感染293T細(xì)胞的梯度稀釋熒光圖片如圖3所示。

表1 梯度稀釋病毒感染293T細(xì)胞后qPCR檢測(cè)NMNAT1 mRNA表達(dá)的結(jié)果Table 1 The NMNAT1 mRNA level in 293T cells treated with step dilutions of lentiviral vectors detected by qPCR

圖3 小鼠NMNAT1基因的RNA干擾慢病毒載體滴度檢測(cè)：熒光圖片顯示梯度稀釋結(jié)果Fig.3 The titer test of lentiviral vectors：the fluorescence figures of reporter gene GFP after gradient dilution of viruses

2.3 慢病毒載體感染Hela細(xì)胞 Hela細(xì)胞在感染攜帶NMNAT1的慢病毒96 h以后，分別收取細(xì)胞的總RNA和總蛋白，通過(guò)qPCR方法和Western Blot方法檢測(cè)NMNAT1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5、表2和表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不加病毒的正常細(xì)胞組和對(duì)照病毒載體感染組不表達(dá)NMNAT1基因，而NMNAT1慢病毒感染96 h的 Hela細(xì)胞組NMNAT1表達(dá)水平明顯增高，表明NMNAT1慢病毒載體感染可以使Hela細(xì)胞顯著表達(dá)NMNAT1的mRNA(圖4和表2)和蛋白質(zhì)(圖5和表3)。在上述基礎(chǔ)上，再用RNA干擾慢病毒感染，96 h后繼續(xù)檢測(cè)NMNAT1基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示其表達(dá)水平下降，說(shuō)明干擾成功(圖4、5)。RNAi組蛋白表達(dá)明顯低于過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組(P＜0.05)，干擾效率在70%以上。

表2 病毒感染Hela細(xì)胞后qPCR檢測(cè)NMNAT1 mRNA的結(jié)果Table 2 The NMNAT1 mRNA level in Hela cells treated with lentiviral vectors detected by qPCR

表3 Western Blot方法檢測(cè)Hela細(xì)胞中NMNAT1表達(dá)的結(jié)果Table 3 The NMNAT1 level in Hela cells treated with lentiviral vectors detected by Western Blot

3 討論

由于神經(jīng)系統(tǒng)以及神經(jīng)元轉(zhuǎn)染的特殊性和難度，我們選用了慢病毒的經(jīng)典方法，構(gòu)建了小鼠NMNAT1基因的過(guò)表達(dá)和RNA干擾慢病毒載體，并包裝成為慢病毒顆粒，通過(guò)RNA水平和蛋白質(zhì)水平的雙重檢測(cè)，確認(rèn)了基因研究工具的有效性［6-7］。慢病毒載體的主要優(yōu)點(diǎn)是它能將外源基因整合入非分裂細(xì)胞的基因組內(nèi)，對(duì)停止分裂的神經(jīng)元轉(zhuǎn)基因治療提供了一個(gè)可行的基因傳遞系統(tǒng)。它的出現(xiàn)彌補(bǔ)了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在轉(zhuǎn)基因治療中的不足。pLenti慢病毒系統(tǒng)只含有HIV-1共9個(gè)基因中的3個(gè)，即gag、pol、rev。因?yàn)?HIV-1基因組成分中60%被去除，因此，父代病毒無(wú)法復(fù)制，載體本身只是將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞內(nèi)的工具［8-9］，其安全性甚至超過(guò)了目前臨床試驗(yàn)正在使用的致癌性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。我們?cè)诖嘶A(chǔ)上，利用慢病毒載體pLenti6系統(tǒng)制備了小鼠NMNAT1基因的過(guò)表達(dá)和RNA干擾慢病毒顆粒，并在體外真核表達(dá)細(xì)胞系Hela中檢測(cè)了它們的上調(diào)和下調(diào)基因表達(dá)水平的有效性［10-11］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，在不表達(dá)小鼠NMNAT1基因的Hela細(xì)胞中，我們制備的慢病毒顆?？梢杂行У乇磉_(dá)出完整全長(zhǎng)且大小正確的小鼠NMNAT1蛋白，而這種表達(dá)同時(shí)也可以被其RNA干擾慢病毒的感染所抑制，從多方面證明了工具的有效性。

RNA干擾是指雙鏈RNA引起的mRNA水平互補(bǔ)序列基因表達(dá)的關(guān)閉，即序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默，是生物體進(jìn)化過(guò)程中抵御外來(lái)基因和病毒感染的保守機(jī)制［12-13］。RNA干擾技術(shù)不僅被廣泛地應(yīng)用于基因功能研究，而且在基因治療中顯示出極大的潛力。慢病毒轉(zhuǎn)染神經(jīng)元以后一般整合到基因組的目的基因拷貝數(shù)在3～10個(gè)左右，更高的整合效率會(huì)引起毒性和整合異常。因此，利用慢病毒系統(tǒng)如此低的轉(zhuǎn)染濃度也可以達(dá)到有效的過(guò)表達(dá)和敲減目的基因的效應(yīng)，說(shuō)明了我們制備的上調(diào)和下調(diào)工具可以用于進(jìn)一步的基因功能研究。已有的針對(duì)NMNAT1基因功能的研究中，一般采用功能缺失型突變體的方法或者采用Wlds重組蛋白(由 Ufd2a，即 U-box-type E4 ubiquitin ligase UFD2a蛋白質(zhì)的N-末端70氨基酸和全長(zhǎng)的NMNAT1酶，從5'-UTR起有18個(gè)氨基酸與Ufd2a相連)的方式進(jìn)行［1-5］。我們的實(shí)驗(yàn)中采用了RNA干擾的方法來(lái)有效降低單個(gè)神經(jīng)元內(nèi)的NMNAT1蛋白的表達(dá)水平，基于如下原因:首先，采用化學(xué)合成siRNA或者慢病毒系統(tǒng)介導(dǎo)的RNAi技術(shù)進(jìn)行神經(jīng)元系統(tǒng)的RNA干擾實(shí)驗(yàn)技術(shù)經(jīng)過(guò)過(guò)去5～7年的發(fā)展，已經(jīng)相對(duì)成熟和完善，有利于功能研究和進(jìn)一步基因治療的可行性探索;其次，RNAi技術(shù)為藥物研究提供了強(qiáng)大的工具，使得近年來(lái)這一新興生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及其在基因治療和藥物開(kāi)發(fā)研究中具有廣泛的應(yīng)用前景，避開(kāi)了傳統(tǒng)針對(duì)NMNAT1蛋白的研究策略和方法，確立了一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的研究思路和實(shí)驗(yàn)體系。在已有關(guān)于NMNAT1基因在軸突退化和神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病機(jī)制的研究基礎(chǔ)上，針對(duì)NMNAT1基因功能本身進(jìn)行基礎(chǔ)性的工作和研究，從而獲得NMNAT1蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病發(fā)病過(guò)程中的更多參與途徑和可能的干預(yù)手段。RNA干擾工具無(wú)疑為我們?cè)诨A(chǔ)研究和機(jī)制探索過(guò)程中提供了有效的研究手段和方法，相應(yīng)的慢病毒技術(shù)有效解決了傳遞系統(tǒng)的瓶頸問(wèn)題，結(jié)合二者優(yōu)點(diǎn)獲得的研究工具為我們進(jìn)一步的工作奠定了基礎(chǔ)。

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Construction of recombinant lentiviral vectors for mouse NMNAT1 gene expression and its interference RNA

ZHAO Hong，YANG Zi-chao，ZHANG Jing-yu
(Department of Neurology，The Fourth Hospital，Harbin Medical University，Harbin 150001，China)

Objective:To construct two recombinant lentiviral vetcors carring mouse NMNAT1 gene and RNAi targeting NMNAT1.Methods:According to GenBank，the full-length cDNA sequence of mouse NMNAT1，an interfering sequence targeting NANAT1 and a negative sequence were designed，synthesized and inserted into plasmid pLenti6 lentiviral vector.The viral stock was prepared by cotransfection of plasmids and the packaging plasmid mix to 293T cells.The virus titer was tested by qPCR methods.After infection of Hela cells with these lentiviruses，the expression of NMNAT1 was detected by qPCR and Western blot.Results:All the recombinant plasmids were confirmed by sequencing.The titer of virus was over 2 ×108TU/mL.Hela cells infected with lentiviral vector carryingfull length NMNAT1 gene successfully expressed high-level NMNAT1.The expression of NMNAT1 reduced to less than 30%after delivery of lentiviral vector carrying RNAi sequence.Conclusions:The lentiviral vectors carrying full length NMNAT1 gene and RNAi sequence targeting NANAT1 have been successfully constructed.

Lentivirus;Recombination，genetic;Plasmides;Genetic vectors;NMNAT1;RNA interference;Gene overexpression

R 319

A

1008-9292(2011)06-0622-08

http:∥www.journals.zju.edu.cn/med

10.3785/j.issn.1008-9292.2011.06.009

2011-06-20

2011-09-09

黑龍江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(D200980).

趙 虹(1966-)，女，博士，研究方向:腦血管病.

張?bào)@宇(1979-)，女，博士，研究方向:腦血管病;E-mail:yang.dh@163.com

［責(zé)任編輯 張榮連］