李春生，徐瑩，姜維，劉文磊，汪東風(fēng)

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島，266003)

水體中的重金屬污染主要源于采礦、冶煉、電鍍、印染等行業(yè)的工業(yè)廢水及生化污水的隨意排放［1－2］。這些重金屬污染物可以通過(guò)食物鏈富集并傳遞，從而對(duì)人類(lèi)飲食安全和身體健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。目前，常用的水體重金屬污染物處理方法主要有絮凝沉淀法、吸附法、離子交換法及生物法等。其中，微生物吸附法因具有細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖快、吸附能力強(qiáng)且比表面積大等特點(diǎn)，已成為當(dāng)前一個(gè)重要的研究方向［3－4］。微生物吸附主要是通過(guò)選擇優(yōu)良的微生物作為吸附劑，直接或與固定化等其他技術(shù)結(jié)合脫除重金屬。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在這方面已做了大量工作，如通過(guò)篩選或構(gòu)建吸附能力強(qiáng)的微生物菌種，改善培養(yǎng)基組成，以及細(xì)胞經(jīng)酸、堿、有機(jī)溶劑處理或化學(xué)修飾、通過(guò)基因工程改造菌株等手段來(lái)提高微生物吸附能力［5－8］。但篩選出在污染環(huán)境中既能大量生長(zhǎng)又有較高重金屬吸附能力的微生物是相當(dāng)艱難的工作。通過(guò)誘導(dǎo)育種構(gòu)建在逆境中既能良好地生長(zhǎng)又能具備重金屬處理性能，并對(duì)環(huán)境無(wú)害的工程菌是實(shí)現(xiàn)該工藝實(shí)際應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一［9］。

酵母菌用于處理水體重金屬污染的研究工作較多，但多數(shù)都集中在采用釀酒酵母這種模式菌來(lái)進(jìn)行的。魯氏酵母是醬油等釀造生產(chǎn)過(guò)程中的常用菌株，其耐鹽性比釀酒酵母的更強(qiáng)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，耐鹽魯氏酵母對(duì) Cd2+有一定的吸附能力［10－11］。但是，為了提高其吸附效率和實(shí)際應(yīng)用，其重金屬鎘脫除能力還需進(jìn)一步提高。本研究旨在以工業(yè)用魯氏酵母為出發(fā)菌株，通過(guò)紫外誘變，選育出對(duì)Cd2+具有更高抗性的菌株;同時(shí)對(duì)所得菌株進(jìn)行鎘生物吸附能力分析，以期選育出對(duì)Cd2+具有更高吸附能力的菌株，為采用微生物法脫除食品及水環(huán)境的重金屬鎘的研究提供有用菌株。

1 材料與方法

1.1 出發(fā)菌株

親株采用魯氏酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii)CICC1379，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基與Cd2+溶液

麥芽汁固體斜面培養(yǎng)基:6～7°Bé的麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基。

YEPD固體平板培養(yǎng)基:蛋白胨20 g，酵母膏10 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，自來(lái)水 1 000 mL，pH 6.0。不加入瓊脂時(shí)即為YEPD液體培養(yǎng)基。

Cd2+溶液:稱(chēng)取適量的CdCl2·2.5H2O(AR，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司)，用超純水溶解，配成Cd2+含量為1 000 mg/L的溶液，使用時(shí)用超純水稀釋到所需濃度。

1.3 Z．rouxii CICC1379鎘抗性水平檢測(cè)

采用最低抑菌濃度(MIC)法，參照文獻(xiàn)［12］。

1.4 紫外線誘變

1.4.1 誘變致死曲線的繪制

參照文獻(xiàn)［13］。

1.4.2 紫外線誘變及篩選

（5）缸筒表面外觀質(zhì)量 激光淬火后，缸筒淬火區(qū)無(wú)明顯的氧化脫碳現(xiàn)象，表面粗糙度值較低，經(jīng)磁粉無(wú)損檢測(cè)后表面無(wú)微小裂紋現(xiàn)象。并經(jīng)專(zhuān)業(yè)的檢測(cè)手段檢測(cè)缸筒淬火區(qū)沒(méi)有變形缺陷產(chǎn)生。

取對(duì)數(shù)期Z．rouxiiCICC1379酵母菌懸液移入帶有磁力攪拌棒的無(wú)菌平板中，選擇合適的紫外線(15 W)照射時(shí)間(致死率為70% ～80%)進(jìn)行紫外誘變。將所得的菌懸液加入到Y(jié)EPD液體培養(yǎng)基，28℃、180 r/min，培養(yǎng)24h。所得的菌體離心(4 000 r/min，10 min)用0.85%無(wú)菌生理鹽水洗滌2次并收集菌體，再將所得菌體用0.85%無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋至濃度約為103個(gè)/mL后涂布到含Cd2+的YEPD固體平板培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)，挑出優(yōu)勢(shì)菌落。將初篩選出的菌株分別進(jìn)行鎘抗性水平檢測(cè)和生物量的測(cè)定，并與親株進(jìn)行比較。根據(jù)以上2個(gè)指標(biāo)篩選出比較理想的菌株。

1.4.3 遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

測(cè)定復(fù)篩選出的菌株的MIC，與培養(yǎng)前菌株的MIC比較后即得到10個(gè)世代的穩(wěn)定性。20世代的穩(wěn)定性測(cè)定，則以24h的培養(yǎng)液作為種子液，以此類(lèi)推，直至50個(gè)世代。

1.5 酵母凍干粉吸附實(shí)驗(yàn)

1.5.1 酵母凍干粉吸附實(shí)驗(yàn)

分別稱(chēng)取0.1 gZ．rouxiiCICC1379和突變株的凍干粉(制備方法參見(jiàn)文獻(xiàn)［10］)，投到裝有20 mL不同鎘濃度梯度的三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為100 r/min的搖床中振蕩吸附30 min。迅速取出并經(jīng)4 000 r/min離心10 min，取上清液，適當(dāng)稀釋后測(cè)定Cd2+濃度。以上清液中Cd2+濃度降低的百分比為Cd2+脫除率(Q)，即:

式中:c0，吸附前溶液中Cd2+濃度，mg/L;ce，吸附后溶液中Cd2+濃度，mg/L。

1.5.2 Cd2+測(cè)定方法

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)所獲得的值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(M±SD)的形式表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 最低抑菌濃度(MIC)的確定及 Z．rouxii CICC1379鎘抗性水平分析

培養(yǎng)時(shí)間與Z．rouxiiCICC1379的MIC之間的關(guān)系如圖1所示。結(jié)果表明，同樣的處理但是經(jīng)過(guò)不同的培養(yǎng)時(shí)間，MIC值明顯地不同。這是因?yàn)樵诘虲d2+濃度條件下，Cd2+只有明顯的抑菌作用，而無(wú)明顯的致死作用，經(jīng)過(guò)適應(yīng)性調(diào)整后仍能夠生長(zhǎng)。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Z．rouxii CICC1379 MIC的影響

培養(yǎng)時(shí)間為24h時(shí)，對(duì)Z．rouxiiCICC1379的MIC進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如表1所示，Z.rouxiiCICC1379的MIC約為6 mg/L，即Z.rouxiiCICC1379的鎘抗性約為6 mg/L。

表1 Z．rouxii CICC1379在含鎘YEPD固體平板培養(yǎng)基培養(yǎng)24h的菌落數(shù)

2.2 Z．rouxii CICC1379的生長(zhǎng)曲線

供誘變處理的酵母菌一般要求處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)群體生長(zhǎng)狀況比較同步，易變異，重復(fù)性較好，故選用對(duì)數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行處理。以培養(yǎng)時(shí)間(t)為橫坐標(biāo)，以每毫升酵母菌個(gè)數(shù)(N)為縱坐標(biāo)，繪制出Z.rouxiiCICC1379的生長(zhǎng)曲線如圖2所示。由圖2可知，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期為4～12 h，為了保證處理時(shí)具有一定的細(xì)胞濃度，以增加可變異的細(xì)胞總數(shù)，故選擇已培養(yǎng)了10 h的菌液進(jìn)行誘變處理。

2.3 紫外線誘變及鎘抗性菌株的篩選

圖2 Z．rouxii CICC1379生長(zhǎng)曲線

2.3.1 紫外誘變致死時(shí)間的確定

紫外誘變處理劑量的選擇是一個(gè)比較復(fù)雜的問(wèn)題，一般正突變較多出現(xiàn)在偏低劑量中，而負(fù)突變則較多出現(xiàn)于偏高劑量中。因此，目前已傾向于低劑量處理細(xì)胞，致死率一般控制在70% ～80%。Z.rouxiiCICC1379紫外誘變致死曲線如圖3所示，紫外線處理時(shí)間為30s時(shí)，致死率為78.85%，故選用紫外線處理時(shí)間30s來(lái)進(jìn)行誘變處理。

圖3 紫外誘變致死曲線

2.3.2 抗性突變株的篩選

為了從紫外誘變所得的菌懸液篩選出較理想的菌株，經(jīng)過(guò)初篩后，挑選出 3株較優(yōu)突變體，即Cd102，Cd103，Cd104，再分別以突變株的生物量及鎘抗性?xún)蓚€(gè)指標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩。初篩獲得的各突變株與Z.rouxii CICC1379的生物量如表2所示。從表2可以看出各突變株的生物量與親株的生物量相比沒(méi)有太大的差異，表明突變過(guò)程對(duì)這些菌株的生長(zhǎng)繁殖影響較小，各突變株生長(zhǎng)繁殖正常。

表2 Z.rouxii CICC1379和誘變菌株生物量及鎘抗性比較

采用MIC法測(cè)定各突變株的鎘抗性水平，由表2可知，突變株Cd102，Cd103，Cd104的鎘抗性較親株分別提高了3.3倍、1.0倍和1.3倍。

由以上兩個(gè)指標(biāo)可以看出，與出發(fā)菌株相比，突變株Cd102鎘抗性提高較明顯，且生長(zhǎng)繁殖正常，因此繼續(xù)對(duì)此菌進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)及鎘吸附能力研究。

2.3.3 突變株Cd102的遺傳穩(wěn)定性

采用MIC法對(duì)Z.rouxiiCICC1379及突變株Cd102進(jìn)行50世代的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 Z．rouxii CICC1379及其突變株Cd102的遺傳穩(wěn)定性

突變株Cd102前30代 Cd2+抗性均保持在100%，第40代遺傳穩(wěn)定性開(kāi)始下降，但下降幅度不大，在第50代其遺傳穩(wěn)定性仍保持在92.3%。由圖4可以看出魯氏酵母突變株Cd102對(duì)Cd2+抗性，具有較高的遺傳穩(wěn)定性，在非選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)50世代，其穩(wěn)定性保持在90%以上。

2.4 突變株的鎘生物吸附能力分析

Z．rouxiiCICC1379與突變株Cd102對(duì)不同初始Cd2+濃度溶液的吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，突變株Cd102的吸附能力明顯地較原始菌株有所提高，即對(duì)于該突變株而言，鎘抗性增強(qiáng)其吸附能力也增強(qiáng)。隨著初始Cd2+濃度的增加，Cd2+脫除率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這是因?yàn)楦叱跏紳舛仍黾恿丝朔嗯c固相之間重金屬傳質(zhì)阻力所需的驅(qū)動(dòng)力，導(dǎo)致了Cd2+與吸附劑的高碰撞幾率，這大大增加了溶液中單位生物量的重金屬吸附數(shù)量，直至達(dá)到飽和，但是由于Cd2+的初始濃度過(guò)高，鎘脫除率卻下降［14］。

圖5 Z.rouxii CICC1379與突變株Cd102凍干粉的Cd2+吸附性能比較

微生物突變體的重金屬抗性與吸附性存在兩種關(guān)系:一種為重金屬的抗性增加但其吸附能力下降，這主要是由于排斥機(jī)制導(dǎo)致其抗性增加［14－15］。另一種為重金屬的抗性與吸附性同時(shí)增加，其機(jī)理主要有兩方面:一方面是由于微生物的表面吸附作用，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后，微生物的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜成分改變，在細(xì)胞表面產(chǎn)生能與重金屬形成晶體的大分子物質(zhì)，吸附重金屬時(shí)，這些大分子物質(zhì)與其螯合，從而增加其吸附能力;另一方面主要是指能進(jìn)行新陳代謝的活細(xì)胞而言，由于微生物細(xì)胞內(nèi)的累積作用，誘變調(diào)動(dòng)了微生物體內(nèi)的抗性基因，在細(xì)胞內(nèi)形成能大量容納重金屬離子的生物大分子，如金屬硫蛋白、操縱子、金屬運(yùn)輸酶和透性酶等，這些物質(zhì)與重金屬離子結(jié)合，形成穩(wěn)定的重金屬離子－生物大分子的結(jié)合態(tài)，從而降低了重金屬對(duì)菌體內(nèi)其他生物物質(zhì)的破壞，增強(qiáng)了突變株對(duì)鎘的抗性和吸附能力［9］。本研究獲得的突變株Cd102的重金屬的抗性與吸附性同時(shí)增加。MIC法測(cè)定其Cd2+抗性為26 mg/L，明顯高于親株(6 mg/L)，相應(yīng)的其Cd2+吸附性能提高較為明顯。初始Cd2+濃 度 分 別 為 0.775、3.205、6.843、36.335、67.075 mg/L時(shí)，突變株Cd102的Cd2+脫除率分別較親株提高了 7.01%、12.85%、15.3%、8.65%、1.07%?？梢?jiàn)，突變株Cd102在中低濃度Cd2+脫除方面較親株表現(xiàn)了更強(qiáng)的吸附能力，而在初始Cd2+濃度為67.075 mg/L時(shí)，突變株Cd102的Cd2+脫除率與親株相近，表明Cd102在脫除高濃度Cd2+方面，其吸附能力并沒(méi)有太大提高。由于本研究采用的是酵母凍干粉吸附實(shí)驗(yàn)，酵母菌處于休眠體狀態(tài)，其吸附機(jī)制主要是由于細(xì)胞的表面吸附作用，由此可以推測(cè)，紫外誘變更多的是導(dǎo)致Cd102細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)上的變化，使其對(duì)Cd2+的選擇性吸附能力增強(qiáng)，而總的吸附位點(diǎn)并沒(méi)有太多增加，表現(xiàn)為其對(duì)高Cd2+下脫除率沒(méi)有太大的變化，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

篩選出遺傳穩(wěn)定的突變株Cd102，其鎘抗性為26 mg/L，較Z.rouxiiCICC1379提高了3.3倍。突變株Cd102的Cd2+吸附性也相應(yīng)的提高，突變株Cd102在中低濃度Cd2+脫除方面較Z.rouxiiCICC1379表現(xiàn)了更強(qiáng)的吸附能力。

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