薛洪燕 施紅旗 陳志梅 王瑞權(quán)

(1.金華市人民醫(yī)院,浙江 金華 321000;2.金華市中心醫(yī)院,浙江 金華 321000)

水的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的必要條件,水通道蛋白(aquaporin,AQP1)是近年發(fā)現(xiàn)的一類高效轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的特異孔道,它與水分子的快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)系密切[1],水通道蛋白1(AQP1)廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物中,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。惡性腫瘤細(xì)胞具有無(wú)限增殖、異常分化、快速生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移等諸多特性,其細(xì)胞形態(tài)和功能的改變離不開水的參與,甚至比正常細(xì)胞更需要水分子的快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。新近研究證實(shí),AQP1對(duì)腫瘤演進(jìn)具有重要作用[2],提示AQP1與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

局部缺氧是實(shí)體腫瘤微環(huán)境普遍存在的一種現(xiàn)象,缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)的一種核轉(zhuǎn)錄因子,HIF-1能與多種靶基因上的缺氧反應(yīng)元件相結(jié)合,進(jìn)而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄活性,從而提高腫瘤細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下的生存率。研究證實(shí),HIF-1為腫瘤信號(hào)傳導(dǎo)的重要因子,與腫瘤演變關(guān)系密切[3-4]。HIF-1能激活血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)基因的轉(zhuǎn)錄活性,這三種分子是否存在內(nèi)在聯(lián)系,以及如何相互作用,國(guó)內(nèi)外均少見報(bào)道。為此,作者通過(guò)檢測(cè)120例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中AQP1、HIF-1α及VEGF的表達(dá)水平,初步探討三者的臨床意義及相互間是否存在相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集金華市人民醫(yī)院及金華市中心醫(yī)院1995年1月～2004年12月120例診斷為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的存檔組織蠟塊,均為女性患者,每例均有詳細(xì)臨床資料、手術(shù)記錄及5年以上的隨訪結(jié)果。術(shù)前均未接受化療和放療?；颊吣挲g24～76歲,中位年齡47.8歲。標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛固定。按Elston和Ellis評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分級(jí),I級(jí)69例,II級(jí)41例,III級(jí) 10例;按TNM 分期,I期44例,II期57例,III期19例。42例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,無(wú)轉(zhuǎn)移者78例。生存時(shí)間≥5年者91例,＜5年者29例,5年生存率75.8%。12例乳腺腺病為同期外科送來(lái)的標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟 4μ m厚切片,脫蠟至水,采用免疫組織化學(xué)EnvisionTM二步法,置于3%H2O2內(nèi)5分鐘滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。抗原修復(fù)后,自然冷卻20分鐘,滴加一抗,4℃冰箱過(guò)夜,PBS沖洗,2分鐘×3次;滴加二抗-HRP多聚體,37℃溫箱內(nèi)孵育20分鐘,PBS沖洗2分鐘×3次;DAB顯色,蒸餾水沖洗、蘇木素襯染,乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封固。

1.2.2 免疫組化主要試劑 鼠抗人AQP1的多克隆抗體為美國(guó)Santa cruz公司產(chǎn)品,抗體按1:100稀釋后應(yīng)用。鼠抗人HIF-1α單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司,鼠抗人VEGF多克隆抗體及免疫組化染色試劑盒購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.2.3 免疫組化結(jié)果判斷 AQP1陽(yáng)性結(jié)果判定:細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜上存在棕黃或棕褐色顆粒判為AQP1陽(yáng)性細(xì)胞,選背景清晰陽(yáng)性表達(dá)效果好的切片作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。每張切片隨機(jī)選擇5～10個(gè)高倍視野,計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞取其平均數(shù)作為陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率。HIF-1α陽(yáng)性僅定位于細(xì)胞核內(nèi),呈棕黃色。高倍鏡(10×40倍)下對(duì)每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞,共計(jì)1000個(gè)腫瘤細(xì)胞。無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為陰性(-),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%為(+),10%～50%為(++),＞50%為(+++)。VEGF陽(yáng)性細(xì)胞為胞漿內(nèi)棕黃色顆粒沉著細(xì)胞。在高倍鏡(10×40倍)下對(duì)每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野,計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞/視野,共計(jì)1000個(gè),計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞總數(shù)×100%。無(wú)染色或陽(yáng)性細(xì)胞百分比＜10%為陰性(-),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10%～30%為(+),30%～50%為(++),＞50%為(+++)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS11.0軟件包,計(jì)數(shù)資料不同組間比較用卡方檢驗(yàn),計(jì)量資料用t檢驗(yàn),應(yīng)用 spearman 等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)對(duì) AQP1、HIF-1α、VEGF表達(dá)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 AQP1的表達(dá) AQP1主要表達(dá)于腫瘤的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞及部分腫瘤細(xì)胞,乳腺腺病組織中無(wú)AQP1表達(dá)。乳腺IDC與乳腺腺病組織相比,AQP1表達(dá)差異有顯著性(t=23.862,P＜0.01)。AQP1表達(dá)與乳腺IDC的腫塊大小(t=23.990,P＜0.01)、TNM分期(t=23.857,P＜0.01)、組織學(xué)分級(jí)(t=23.835,P＜0.01)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否(t=23.981,P＜0.01)和腫瘤壞死與否(t=23.985,P＜0.01)有關(guān),兩者或三者之間有顯著性差異,而與患者年齡和術(shù)后5年生存率無(wú)關(guān)(P＞0.05),見表1。

2.2 HIF-1α的表達(dá) HIF-1α表達(dá)于細(xì)胞核,其陽(yáng)性細(xì)胞主要出現(xiàn)于腫瘤邊緣或與正常組織交界處,在壞死的腫瘤組織周圍的癌細(xì)胞中陽(yáng)性表達(dá)尤為明顯,乳腺IDC組織中HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性率為44.2%,12例乳腺腺病組織中HIF-1α表達(dá)均陰性,乳腺IDC和乳腺腺病組織相比,HIF-1α表達(dá)差異有顯著性(χ2=11.16,P＜0.01)。HIF-1α表達(dá)率與乳腺IDC的腫塊大小(t=22.392,P＜0.01)、TNM分期(t=20.793,P＜0.01)、組織學(xué)分級(jí)(t=6.035,P＜0.05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否(t=10.606,P＜0.01)和腫瘤壞死與否(t=21.541,P＜0.01)有關(guān),兩者或三者之間有顯著性差異,而與患者年齡和術(shù)后5年生存率無(wú)關(guān)(P＞0.05),見表1。

2.3 VEGF的表達(dá) VEGF表達(dá)于癌細(xì)胞胞質(zhì),乳腺IDC組織中VEGF表達(dá)陽(yáng)性率為62.5%,12例乳腺腺病組織中VEGF表達(dá)均陰性,乳腺IDC和乳腺腺病組織相比,VEGF表達(dá)差異有顯著性(χ2=13.76,P＜0.01)。VEGF表達(dá)率與乳腺IDC的腫塊大小(χ2=9.163,P ＜0.01)、TNM 分期(χ2=11.362,P＜0.01)、組織學(xué)分級(jí)(χ2=11.408,P＜0.01)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否(χ2=11.966,P＜0.01)和腫瘤壞死與否(χ2=18.020,P＜0.01)有關(guān),兩者或三者之間有顯著性差異,而與患者年齡和術(shù)后5年生存率均無(wú)關(guān)(P＞0.05),見表1。

2.4 乳腺IDC組織HIF-1α與AQP1和 VEGF表達(dá)的相關(guān)性 AQP1與HIF-1α、VEGF兩兩比較呈正相關(guān)(r=0.555,r=0.495,r=0.377,均 P＜0.01)。

3 討 論

局部缺氧是包括乳腺癌在內(nèi)的實(shí)體腫瘤普遍存在的一種現(xiàn)象,也是實(shí)體瘤微環(huán)境的基本特征,同時(shí)腫瘤細(xì)胞缺氧也成為腫瘤惡性轉(zhuǎn)化甚至轉(zhuǎn)移的啟動(dòng)因子。HIF-1是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)的一種核轉(zhuǎn)錄因子,能激活多種基因的轉(zhuǎn)錄活性,這些基因的蛋白產(chǎn)物包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、內(nèi)皮素1(endotheltin-1)、糖酵解酶等,進(jìn)而參與維持腫瘤細(xì)胞的能量代謝、新血管生成、促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移[5]。大多數(shù)腫瘤表現(xiàn)為更高的血管滲透性及細(xì)胞間質(zhì)液壓力的增高,導(dǎo)致局部缺氧,缺氧可直接刺激HIF-1表達(dá)升高。本組檢測(cè)結(jié)果顯示,12例乳腺腺病組織中均未見HIF-1α的表達(dá),而乳腺IDC陽(yáng)性表達(dá)率為44.2%,并與乳腺IDC的腫塊大小、TNM分期、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤壞死和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān);同時(shí)發(fā)現(xiàn),在乳腺IDC的壞死區(qū)周圍更易見到HIF-1α陽(yáng)性細(xì)胞,同時(shí)這些區(qū)域的AQP1也都高表達(dá),另外,腫瘤浸潤(rùn)的邊緣或間質(zhì)血管增生處HIF-1α往往呈陽(yáng)性表達(dá),提示HIF-1α過(guò)表達(dá)往往伴隨血管生成、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。

表1 乳腺腺病及乳腺IDC中AQP1、HIF-1α和VEGF表達(dá)

局部缺氧,也將影響細(xì)胞的能量代謝及細(xì)胞膜離子通道的功能,進(jìn)而可能影響細(xì)胞膜上水通道蛋白的功能。水通道蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞及組織間水的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),可有效地調(diào)節(jié)細(xì)胞及組織間的液壓力,調(diào)節(jié)局部缺氧程度,間接影響HIF-1的表達(dá),可見,AQP1與HIF-1α之間可能存在著復(fù)雜的病理生理聯(lián)系。本組結(jié)果顯示,HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)組的AQP1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率較HIF-1α陰性表達(dá)組明顯高,表明兩者在生化水平上存在一定的關(guān)聯(lián),在功能上可能存在相互作用機(jī)制。AQP1正常在血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿或胞膜中表達(dá),研究表明AQP1在許多腫瘤的血管生成過(guò)程中起重要作用[6]。本組結(jié)果顯示,AQP1在乳腺IDC的表達(dá)高于乳腺腺病的表達(dá),并且其表達(dá)與腫塊大小、TNM分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤壞死有關(guān)。AQP1過(guò)表達(dá)表明腫瘤間質(zhì)中不僅有大量新生微血管,而且AQP1介導(dǎo)的水分子快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有助于水分及其攜帶的大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入到周圍的組織間隙中,滿足腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝并為其向周圍組織侵襲浸潤(rùn)提供充分的物質(zhì)基礎(chǔ)。Baluk等[7]有關(guān)腫瘤毛細(xì)血管上AQP1基因表達(dá)的研究提示,腫瘤異常血管的形成可能是通過(guò)增強(qiáng)血管的滲透性和組織間隙的壓力來(lái)實(shí)現(xiàn)的。VEGF是參與腫瘤血管生成的主要直接調(diào)控因子之一,有研究發(fā)現(xiàn)在VEGF基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游存在HIF-1α結(jié)合位點(diǎn),HIF-1α可促進(jìn)VEGF基因轉(zhuǎn)錄和翻譯,誘導(dǎo)血管形成[8]。本組結(jié)果顯示乳腺IDC組織中VEGF的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于乳腺腺病組織,并與乳腺IDC的腫塊大小、TNM分期、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤壞死和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。經(jīng)分析AQP1與HIF-1α、VEGF表達(dá)變化,結(jié)果顯示兩兩比較呈正相關(guān)(r=0.555、r=0.495、r=0.377,P＜0.01),推測(cè)通過(guò)AQP1介導(dǎo)的高滲透性引起流體靜力壓的增高,并且隨之引起缺氧,缺氧狀態(tài)下HIF-1α基因激活,通過(guò)調(diào)控VEGF的轉(zhuǎn)錄而促進(jìn)乳腺IDC組織中新生血管的生成。乳腺癌組織雌激素受體、孕激素受體、表皮生長(zhǎng)因子受體靶分子信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)及調(diào)控機(jī)制的闡明,已深刻地揭示了其在乳腺癌演進(jìn)過(guò)程中的重要意義,已成為選擇治療策略的重要依據(jù)。通過(guò)乳腺癌組織中AQP1與HIF-1α、VEGF相關(guān)性研究,初步探討其間存在的關(guān)系,為進(jìn)一步探明生物靶分子之間相互作用的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制,特別是尋找新的分子治療靶點(diǎn),進(jìn)而為乳腺癌的防治提供有益幫助。

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