邊洋 塔娜 李林 鄭嶠 張順民 鄭建明 左長京
·論著·
MCP-1在小型豬慢性阻塞性胰腺炎組織中的表達及其意義
邊洋 塔娜 李林 鄭嶠 張順民 鄭建明 左長京
目的檢測慢性阻塞性胰腺炎小型豬血單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)含量及胰腺組織MCP-1蛋白表達,探討其在胰腺纖維化中的作用。方法采用不全結扎主胰管方法建立小型豬慢性阻塞性胰腺炎模型,術后4、6、8周分批處死動物。觀察胰腺病理變化;膠原(VG)染色評估胰腺纖維化程度;ELISA法檢測血MCP-1濃度;免疫組化法檢測胰腺組織MCP-1、α-SMA、PDGF、TGF-β1和NF-κB表達。結果造模成功14頭(58.3%)。術后4周起胰腺體尾部呈萎縮性改變,間質纖維組織增生,炎細胞浸潤,第8周改變最明顯。胰腺纖維化Ⅰ期5頭(35.7%),Ⅱ期4頭(28.6%),Ⅲ期5頭(35.7%)。術后4、6、8周造模成功組血MCP-1含量分別為(102.44±36.25)pg/ml、(97.84±28.67)pg/ml、(94.32±28.42)pg/ml,顯著高于對照組的(10.42±5.86)pg/ml、(8.58±4.86)pg/ml、(8.22±4.58)pg/ml(P值均<0.01)。對照組胰腺無MCP-1蛋白表達,造模成功組胰腺組織內見MCP-1蛋白表達,且MCP-1表達與α-SMA、PDGF、TGF-β1和NF-κB表達呈正相關。結論MCP-1在慢性阻塞性胰腺炎胰腺纖維化過程中起重要作用。
胰腺炎,慢性; 趨化因子類; 單核細胞趨化蛋白-1; 星形細胞; 纖維化
單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein 1,MCP-1)是CC類趨化因子家族中的主要成員之一,對單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞具有很強的趨化活性,在免疫炎癥反應、動脈粥樣硬化等一系列疾病過程中發(fā)揮重要作用。近年來研究表明,MCP-1在慢性胰腺炎(CP)胰腺纖維化過程中發(fā)揮著十分重要的作用。本文檢測慢性阻塞性胰腺炎小型豬的血MCP-1含量及胰腺組織MCP-1蛋白表達,探討其在胰腺纖維化發(fā)展中的作用及其機制。
一、實驗動物及分組
36頭20~25 kg的雌性巴馬小型豬,月齡6~12個月,體重20~ 25 kg,由第二軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。按數字表法隨機分為實驗組(24頭)和對照組(12頭)。參考文獻[1]的方法,即用3.0號絲線把主胰管與雙股3.0號聚丙烯線一起結扎,建立阻塞性胰腺炎模型。對照組僅翻動胰腺數次。術中取右葉胰腺組織置-180℃液氮保存。造模后4、6、8周分批處死動物,取胰腺常規(guī)固定。術后4、6、8周抽取外周血,分離血清備用。
二、血MCP-1濃度檢測
采用ELISA法,試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司,嚴格按說明書操作。應用酶標儀測定各孔A450值。用MCP-1的標準蛋白做標準曲線,根據標準曲線計算標本中MCP-1的含量。
三、胰腺病理形態(tài)學觀察及膠原纖維染色
常規(guī)行病理學檢查。按照胰腺腺泡萎縮、炎細胞浸潤和纖維化程度(主要根據胰腺纖維化的程度)分為三期[2]:Ⅰ期為輕微纖維化,即間質纖維組織輕度增生,胰腺腺泡輕度萎縮,較多淋巴細胞、漿細胞和少量巨噬細胞浸潤;Ⅱ期為中度纖維化,即纖維組織明顯增生,胰腺腺泡明顯萎縮,間質內較多淋巴細胞、漿細胞浸潤;Ⅲ期 為重度纖維化,即間質纖維組織大量增生,胰腺的外分泌實質幾乎完全被破壞,胰腺腺泡顯著萎縮,間質內少量淋巴細胞、漿細胞浸潤。同時,采用VG染色觀察胰腺組織纖維化程度。
四、胰腺組織蛋白表達的檢測
采用免疫組化方法,按說明書操作??筆DGF、TGF-β1、NF-κB和α-SMA抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司。用TBS代替一抗作為空白對照。MCP-1、PDGF、TGF-β1和α-SMA均表達于細胞質內,NF-κB表達于細胞核和(或)細胞質內,出現棕黃色顆粒為陽性細胞。根據細胞染色強度評分:未染色,0分;黃褐色1分;褐色2分;深褐色3分。按陽性細胞率評分:<5% 0分;5%~10% 1分;11%~25% 2分;26%~50% 3分;>50% 4分。將兩分值相加, ≤2分為陰性,>2分為陽性。
五、統(tǒng)計學分析
一、造模成功率
實驗組1頭豬因麻醉意外死亡,2頭在造模術后1~2周內死亡,解剖顯示胰管損傷,胰液外漏伴腹腔感染。實驗組造模成功14頭,成功率58.3%。
二、血MCP-1含量的變化
術后4、6、8周對照組血MCP-1含量分別為(10.42±5.86)pg/ml、(8.58±4.86)pg/ml、(8.22±4.58)pg/ml;造模成功組分別為(102.44±36.25)pg/ml、(97.84±28.67)pg/ml、(94.32±28.42)pg/ml,兩組相差顯著(P值均<0.01)。
三、胰腺病理學變化
對照組胰腺無病理形態(tài)學改變。造模成功組自術后4周起胰腺呈灰紅色,質地較硬(圖1),體尾部輕度萎縮,切面結節(jié)狀。鏡檢示胰腺分葉狀結構不同程度遭到破壞,胰腺腺泡萎縮、纖維組織增生,間質內散在淋巴細胞、漿細胞浸潤(圖2),VG染色示大量纖維組織增生(圖3),以術后8周改變最明顯。其中Ⅰ期5頭(35.7%),Ⅱ期4頭(28.6%),Ⅲ期5頭(35.7%)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期豬的血MCP-1含量分別為(100.38±28.42)pg/ml、(98.26±24.36)pg/ml和(96.28±26.44)pg/ml,無顯著差異。
四、MCP-1、PDGF、TGF-β1、NF-κB和α-SMA蛋白的表達
造模成功組造模后4、6、8周胰腺組織內均見MCP-1蛋白表達,定位于胰腺泡心導管、內皮細胞、成纖維細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞胞質內(圖4),且隨分期增加表達逐漸增強,以Ⅲ期最為顯著(表1),但無顯著性差異。MCP-1蛋白表達與α-SMA、PDGF、TGF-β1和NF-κB表達呈正相關(P<0.01)。
圖1實驗組4周的胰腺圖2胰腺的病理改變(HE ×100)圖3胰腺內大量纖維組織增生(VG ×100)圖4胰腺MCP-1蛋白表達(免疫組化 ×200)
分期例數MCP-1α-SMAPDGFTGF-β1NF-κBⅠ期55.4±0.45.5±0.54.8±0.65.2±0.65.3±0.5Ⅱ期45.7±0.55.8±0.65.4±0.45.3±0.55.6±0.5Ⅲ期56.3±0.66.1±0.65.6±0.65.4±0.66.3±0.6
以往CP動物模型多以鼠、貓等小型動物為對象,采用飲食、蛙皮素靜脈內注射及胰管內注射等方法制成和人類相似的CP,但對于影像診斷和外科治療的實驗研究有一定的局限性。由于豬的消化系統(tǒng)和人很相似,且能夠滿足影像診斷和外科治療的要求,因此豬是較理想的CP模型動物。目前已有采用主胰管結扎法建立豬CP模型的報道[2-3]。本實驗選擇巴馬小型豬制作慢性阻塞性胰腺炎模型,結果顯示其病理表現與人類的慢性阻塞性胰腺炎類似。
CP與免疫、細胞因子、基因突變、細胞凋亡有密切的關系,其中細胞因子在CP胰腺纖維化過程中起著十分重要的作用[3]。Inoue等[4]以二丁基二氯化錫誘導大鼠CP模型,其胰腺組織和血清中MCP-1 mRNA和蛋白濃度均明顯增加。Zhao等[5]給該模型肌內注射能與MCP-1競爭結合的MCP-1突變體,結果血清MCP-1水平明顯下降,胰腺炎癥和纖維化發(fā)生率下降50%。Saurer等[6]用原位雜交方法檢測23例CP和4例對照正常胰腺組織MCP-1 mRNA的表達,結果顯示,MCP-1 mRNA在正常胰腺組織中不表達,CP組織則強表達。本實驗結果顯示,胰腺MCP-1的蛋白表達及血MCP-1含量隨CP分期增加逐漸增強,以Ⅲ期最為顯著。
Gharaee-Kermani等[7]報道,MCP-1通過上調TGF-β1水平促進纖維化發(fā)生。Zhao等[5]報道,抗MCP-1基因治療能顯著降低胰腺TGF-β、PDGF、IL-1β和IL-6表達水平。本實驗結果亦顯示,MCP-1與α-SMA、PDGF、TGF-β1和NF-κB表達呈正相關。
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2010-04-07)
(本文編輯:呂芳萍)
ExpressionofMCP-1inthepancreasofpigletwithchronicobstructivepancreatitisanditssignificance
BIANYang,TANa,LILin,ZHENGQiao,ZHANGShun-min,ZHENGJian-ming,ZUOChang-jing.
Grade2007,Five-yearClinicalCourse,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China
ObjectiveTo determine the serum concentration of MCP-1 and the expression of MCP-1 protein in the pancreas in the piglet with chronic obstructive pancreatitis and to explore the role of MCP-1 protein in pancreatic fibrosisits.MethodsThe piglet model of chronic obstructive pancreatitis was established by incomplete ligation of the pancreatic duct. The piglets were sacrificed at 4, 6, 8 weeks after induction. Pathological changes of pancreas were examined. Pancreatic fibrosis was assessed by VG staining. Serum MCP-1 concentrations were detected by ELISA method. MCP-1 and α-SMA, PDGF, TGF-β1 and NF-κB protein expression were detected by immunohistochemistry.ResultsThe induction was successful in 14 piglets (58.3%). Mild atrophic changes, interstitial fibrosis, chronic inflammatory cell infiltration could be observed in the body and tail of pancreas from the 4th week in the experimental group. The most obvious changes occurred in the 8th week. Stage I pancreatic fibrosis occurred in 5 piglets (35.7%), stage Ⅱ in 4 piglets (28.6%), stage Ⅲ in 5 rats (35.7%). Seurm MCP-1 at 4, 6, 8 weeks was (102.44±36.25)pg/ml, (97.84±28.67)pg/ml, (94.32±28.42)pg/ml,respectively, and was significantly higher than that in control group [(10.42±5.86)pg/ml, (8.58±4.86)pg/ml, (8.22±4.58)pg/ml,P<0.01]. There was no MCP-1 protein expression in the control group; MCP-1 protein was detected in the successful induction group, and MCP-1 expression was positively correlated with expressions of the PDGF, TGF-β1, α-SMA and NF-κB.ConclusionsMCP-1 may play an important role in the course of pancreatic fibrosis in chronic obstructive pancreatitis.
Pancreatitis, chronic; Chemotactic factors; Monocyte chemoattractant protein-1; Astrocytes; Fibrosis
Commoncorrespondingauthor:ZHENGJian-ming,Email:jmzheng1962@163.com;ZUOChang-jing,Email:changjing.zuo@gmail.com
10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.06.011
上海市科委國際合作科研基金(10410708800);2009年校大學生創(chuàng)新能力培養(yǎng)計劃立項課題面上項目
200433 上海,第二軍醫(yī)大學臨床醫(yī)學本科五年制2007級學員隊(邊洋、塔娜、李林、鄭嶠);長海醫(yī)院病理科(張順民、鄭建明),核醫(yī)學科(左長京)
共同通信作者:鄭建明,Email:jmzheng1962@163.com;左長京,Email:changjing.zuo@gmail.com