石亮亮 劉明東 陳敏 鄒曉平

·論著·

急性壞死性胰腺炎大鼠腸道Cajal間質(zhì)細(xì)胞以及c-kit mRNA表達(dá)的改變

石亮亮 劉明東 陳敏 鄒曉平

目的檢測急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠小腸組織中Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)的改變，探討其參與胃腸道動力障礙的機(jī)制。方法24只雄性SD大鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分為ANP組和對照組，各12只。采用膽總管逆行注射5%牛磺膽酸鈉建立ANP大鼠模型。術(shù)后23 h自胃管注入美藍(lán)1.0 ml，1 h后處死大鼠，測量幽門至藍(lán)染距離，計算活體腸道推進(jìn)率；胰腺和小腸組織常規(guī)病理檢查；應(yīng)用免疫組化和實時PCR法檢測ICC標(biāo)志物酪氨酸激酶(c-kit)蛋白及mRNA的表達(dá)；應(yīng)用透射電鏡觀察ICC超微結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果ANP組胰腺腺泡細(xì)胞小葉結(jié)構(gòu)破壞，片狀出血，灶性壞死，大量炎癥細(xì)胞浸潤；小腸黏膜水腫、糜爛，炎癥細(xì)胞浸潤。ANP組腸道推進(jìn)率為(41.55±3.85)%，較對照組的(68.66±2.66)%顯著下降(P<0.05)；c-kit陽性細(xì)胞數(shù)較對照組減少(56.11±5.09對88.47±4.49，P<0.05)；c-kit mRNA表達(dá)亦較對照組下降(0.64±0.33對1.29±0.91，P<0.05)。ANP組ICC的線粒體空泡變，周圍突起減少，與平滑肌細(xì)胞之間的連接結(jié)構(gòu)不清。結(jié)論ICC減少和超微結(jié)構(gòu)改變是ANP時胃腸道動力障礙的重要機(jī)制之一，而ICC的這些改變可能是由于c-kit基因表達(dá)下降所致。

胰腺炎，急性壞死性； 小腸； Cajal間質(zhì)細(xì)胞

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)早期即出現(xiàn)胃腸動力障礙。Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of cajal,ICC)具有胃腸起搏功能并能調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，在胃腸電活動及動力發(fā)生中有著重要的作用。本研究觀察急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠腸道ICC的變化，探討其在ANP時胃腸道動力障礙發(fā)生中的作用。

材料與方法

一、實驗動物及分組

雄性SD大鼠(200～250 g)24只，清潔級，購自南京鼓樓醫(yī)院實驗動物中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。按數(shù)字表法隨機(jī)分為ANP組和對照組，各12只。采用膽總管逆行注射5%牛磺膽酸鈉1. 0 ml/kg體重建立大鼠ANP模型。對照組大鼠在開腹后僅翻動十二指腸并觸摸胰腺數(shù)次后關(guān)腹。

二、大鼠腸道動力測定

術(shù)后23 h自胃管注入美藍(lán)1.0 ml，1 h后處死大鼠，取出小腸，測量幽門至藍(lán)染距離，計算活體腸道推進(jìn)率(所測距離/幽門至回盲部小腸總長度×100%)，以此判斷胃腸道轉(zhuǎn)運功能。

三、胰腺及小腸組織病理學(xué)檢查

取大鼠胰腺組織和曲氏韌帶下5 cm的小腸組織，常規(guī)行病理學(xué)檢查。

四、ICC標(biāo)志物酪氨酸激酶(c-kit)蛋白及mRNA檢測

小腸固定標(biāo)本經(jīng)蔗糖梯度脫水、OCT包埋、切片，采用免疫組化法檢測c-kit蛋白。棕色的細(xì)胞為陽性細(xì)胞。通過Image pro plus 6.0軟件半定量計算陽性面積A值表示c-kit陽性細(xì)胞數(shù)量。

新鮮小腸組織用Trizol抽提總RNA。c-kit上游引物5′-TGGATCAGCAAATGTCACAACAAC-3′，下游引物5′-TAGGCCTCGAACTCAACAACCA-3′，擴(kuò)增片段132 bp；β-actin上游引物5′-TCGTGCGTGACATTAAAGAG-3′， 下游引物5′-ATTGCCGATAGTGATGACCT-3′，擴(kuò)增片段134 bp。引物由寶生物工程有限公司設(shè)計合成。以1 μg總RNA為模板，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。于ABI PRISM 7500熒光實時定量PCR儀上行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件： 95℃ 10 s，95℃ 5 s、60℃ 34 s，45個循環(huán)；溶解曲線分析：95℃ 15 s,60℃ 60 s，95℃ 15 s。每個樣本重復(fù)3次，取Ct平均值，c-kit mRNA相對表達(dá)量用2-△△Ct法計算。

五、回腸ICC超微結(jié)構(gòu)觀察

沿縱軸剖開小腸，在裝有Kreb′s液的燒杯中取出腸內(nèi)容物，立即置入5%的戊二醛中固定，固定后將組織切成1 mm×5 mm的條，用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液沖洗，用2%的四氧化鋨固定2 h后，再用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液沖洗，然后在丙酮中梯度脫水，通過浸透、樹脂聚合、精確定位后進(jìn)行超薄切片，用1%醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色后，透射電鏡觀察。

六、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、胰腺和小腸的病理形態(tài)學(xué)改變

對照組大鼠無死亡，胰腺和小腸結(jié)構(gòu)正常。ANP組死亡2只，?；悄懰徕c注射后即可見胰腺明顯充血、水腫，24 h后開腹可見胰腺出血、壞死，部分有血性腹水形成，光鏡下可見胰腺腺泡細(xì)胞間隙增寬，小葉結(jié)構(gòu)破壞，片狀出血，灶狀壞死，大量炎癥細(xì)胞浸潤(圖1)；小腸黏膜水腫、糜爛，腺體結(jié)構(gòu)紊亂，炎癥細(xì)胞浸潤(圖2)。

二、胃腸道動力改變

ANP組大鼠胃腸道脹氣明顯，腸道內(nèi)大量滲出液。ANP組活體腸道推進(jìn)率為(41.55±3.85)%，較對照組的(68.66±2.66)%明顯下降(P<0.05)。

圖1 對照組(a)和ANP組(b)胰腺組織病理改變(HE ×200)

圖2 對照組(a)和ANP組(b)小腸組織病理改變(HE ×100)

三、腸道c-kit蛋白及mRNA的表達(dá)

c-kit蛋白定位于黏膜下內(nèi)環(huán)肌層表面以及環(huán)肌層和縱肌層之間的肌間神經(jīng)叢的ICC胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色(圖3)。對照組c-kit的平均A值為88.47±4.49，ANP組為56.11±5.09，較對照組明顯減少(P<0.05)。對照組c-kit mRNA表達(dá)量為1.29±0.91，ANP組為0.64±0.33，亦較對照組明顯減少(P<0.05)。

四、ICC超微結(jié)構(gòu)的變化

對照組的ICC形態(tài)為三角形或梭形,細(xì)胞核比較大，周圍包繞少量胞質(zhì),胞質(zhì)的電子密度高于周圍的其他細(xì)胞，且有長的突起圍繞著神經(jīng)節(jié)的外圍，并與平滑肌細(xì)胞連接(圖4a)。ANP組ICC的線粒體空泡變，周圍突起減少，與平滑肌細(xì)胞之間的連接結(jié)構(gòu)不清(圖4b)。

圖3對照組(a)和ANP組(b)小腸組織內(nèi)c-kit陽性表達(dá)細(xì)胞(免疫組化 ×200)

討 論

研究表明，胰腺壞死組織感染的細(xì)菌大部分來源于腸道[1]。細(xì)菌易位的主要機(jī)制是SAP時胃腸道運動功能的改變導(dǎo)致腸道內(nèi)細(xì)菌的滯留和過度繁殖，再加上腸道屏障破壞所致[2]。近年臨床研究發(fā)現(xiàn)，胃腸功能恢復(fù)早者，病情好轉(zhuǎn)較快[3]。因此，改善胃腸道動力對SAP患者預(yù)后有著重要的影響。

圖4 對照組(a)和ANP組(b)ICC的超微結(jié)構(gòu)改變

c-kit/SCF信號通路在ICC發(fā)育和維持中有著重要的作用[4-5]。研究表明，ICC的數(shù)目和分布的異常與眾多胃腸道動力障礙性疾病，如Hirschsprung′S病、Chagas′病、先天性巨結(jié)腸、少年肥厚型幽門梗阻、慢傳輸性便秘等有關(guān)。王廣勇等[6]報道，急性壞死性胰腺炎豚鼠胃腸動力減弱，小腸肌間神經(jīng)叢c-kit陽性細(xì)胞數(shù)減少。本實驗結(jié)果亦顯示，ANP組大鼠小腸c-kit陽性細(xì)胞數(shù)較對照組減少，小腸c-kit mRNA表達(dá)量亦較對照組明顯下降，表明ANP時ICC的c-kit mRNA及蛋白表達(dá)的減少參與胃腸道動力障礙機(jī)制。

樓征等[7]報道，腹腔感染和腹腔高壓大鼠模型的回腸肌間神經(jīng)叢的ICC的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。本實驗結(jié)果顯示，ANP組ICC的線粒體發(fā)生空泡化，ICC的胞質(zhì)突起減少，與平滑肌細(xì)胞之間的連接結(jié)構(gòu)不清。與Filipoiu等[8]的結(jié)果一致。ICC內(nèi)線粒體空泡化勢必影響ICC的能量代謝，從而影響其功能的正常發(fā)揮。ICC可與腸運動神經(jīng)元釋放的乙酰膽堿結(jié)合，并通過平滑肌細(xì)胞的縫隙連接產(chǎn)生興奮性連接電位，使平滑肌細(xì)胞收縮，ANP時ICC與平滑肌縫隙連接的破壞，導(dǎo)致平滑肌收縮功能降低。

總之，ICC減少和超微結(jié)構(gòu)改變是ANP時胃腸道動力障礙的重要機(jī)制之一，而ICC的這些改變可能是由于c-kit基因表達(dá)的下降所致。至于ICC與其他參與胃腸動力改變的因素是否相關(guān)還有待進(jìn)一步研究。

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2010-03-16)

(本文編輯：呂芳萍)

ChangesofinterstitialcellsofCajalandc-kitmRNAexpressioninjejunumofratsofexperimentalacutenecrotizingpancreatitis

SHILiang-liang,LIUMing-dong,CHENMin,ZOUXiao-ping.

DrumTowerClinicalMedicalCollege,NanjingMedicalUniversity,Nanjing210008,China

ZOUXiao-ping,Email:zouxiaoping795@hotmail.com

ObjectiveTo observe the changes of Interstitial cells of Cajal (ICC) and c-kit mRNA expression in jejunum of rats of experimental acute necrotizing pancreatitis (ANP), and to investigate its possible mechanism of gastrointestinal dysmotility.Methods24 male SD rats were randomly divided into ANP group and control group with 12 rats in each group. ANP rats were induced by choledochal retrograde injection of 5% sodium taurocholate. 1.0 ml of methylene blue was injected through gastric tube 23 h after induction, and 1 h later the rats were sacrificed. The distance from pylorus to methylene blue stained place was measured, and intestinal motility was assessed by testing small intestinal propulsion rate. Pancreatic and intestinal tissues were routinely sent to pathological examination. Immunohistochemical staining and RT-PCR method was used to detect the c-kit protein and mRNA expression of ICC in jejunum. Ultrastructures of ICC were evaluated by transmission electron microscopy.ResultsDestroyed lobular structure of pancreatic acinar cells, flake bleeding and focal necrosis, large amount of inflammatory cell infiltration was observed; mucosal edema, erosion and inflammatory cell infiltration was also observed. Compared with control group, the small intestinal propulsion rate of ANP group decreased significantly [(41.55±3.85)%vs(68.66±2.66)%,P<0.05)], fewer positive c-kit area (56.11±5.09vs88.47±4.49,P<0.05) and fewer c-kit mRNA expression (0.64±0.33vs1.29±0.91,P<0.05) was detected. Vacuolation of mitochondria of ICC in ANP group and decreased surrounding apophyses, vague connecting structure with adjacent smooth muscle cells were observed.

ConclusionsDecrease of ICC and ultrastructural changes play an important role in intestinal dysmotility during ANP, and the changes of ICC may be resulted from the reduced expression of c-kit gene.

Pancreatitis, acute necrotizing; Intestine, small; Interstitial cells of Cajal

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.06.009

210008 南京，南京醫(yī)科大學(xué)附屬鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院(石亮亮)；南京醫(yī)科大學(xué)附屬鼓樓醫(yī)院消化科(劉明東、陳敏、鄒曉平)

鄒曉平，Email:zouxiaoping795@hotmail.com