陳 雪, 程金平 張鑒達(dá) 宋玉玲 王文華 于金蓮

（1. 上海交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 上海200240; 2. 上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 上海 200234）

麻痹性貝毒對(duì)肝臟和腎臟氧化損傷的影響

陳 雪1,2, 程金平1, 張鑒達(dá)1, 宋玉玲1, 王文華1, 于金蓮2

（1. 上海交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 上海200240; 2. 上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 上海 200234）

為了探討麻痹性貝毒（PSP）對(duì)肝臟和腎臟損傷的機(jī)制, 采用膝溝藻毒素 GTX-1, 4對(duì)小鼠進(jìn)行急性暴露, 劑量為1μg/kg, 時(shí)間分別為60、90、120min。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 與對(duì)照組相比, 肝臟染毒組中的還原型谷胱甘肽（GSH）含量沒有顯著變化; 在腎臟中, 60 min時(shí)染毒組GSH含量沒有明顯變化, 90、120 min時(shí)GSH含量降低 ; 兩器官中抗氧化酶（GSH-Px、SOD）活性與對(duì)照組相比均無顯著變化（P＞0.05）。從而推斷, GSH參與了PSP對(duì)腎臟損害的毒性過程; 腎中GSH含量有可能作為PSP早期檢測(cè)的敏感指標(biāo)。

麻痹性貝毒; 氧化損傷; 肝臟; 腎臟

麻痹性貝毒（paralytic shellfish poisoning, PSP）是一類阻斷神經(jīng)細(xì)胞鈉離子通道, 對(duì)人體神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生麻痹作用的海洋生物毒素, 主要來源于可導(dǎo)致赤潮的海洋甲藻[1]。在目前已知的海洋藻類毒素中,PSP被認(rèn)為是發(fā)生頻率最高、對(duì)人類影響最為嚴(yán)重的毒素, 因此成為海洋科學(xué)研究的重點(diǎn)之一。人們已對(duì)PSP的毒性特點(diǎn)、代謝途徑和貝類水產(chǎn)品中PSP污染狀況進(jìn)行了大量的研究工作[2,3]。近年來, 利用有機(jī)毒物引起的機(jī)體生態(tài)效應(yīng)的改變作為敏感的生物指標(biāo), 監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)微量有機(jī)毒物的危害[4], 已受到國內(nèi)外普遍關(guān)注。

PSP毒素在體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化, 產(chǎn)生自由基, 自由基的過量生成會(huì)導(dǎo)致膜系統(tǒng)發(fā)生脂質(zhì)過氧化, 進(jìn)一步損害靶器官。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)[5]PSP對(duì)動(dòng)物肝、腎功能損害相對(duì)比較嚴(yán)重, 造成這種情況的原因可能與PSP的代謝有關(guān)。PSP引起組織氧化損傷的實(shí)驗(yàn)研究,尤其是對(duì)肝腎形態(tài)學(xué)的觀察, 國內(nèi)尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)選擇肝腎為研究對(duì)象, 探討 PSP對(duì)小鼠的氧化損傷及其毒性影響, 旨在為進(jìn)一步研究脂質(zhì)過氧化發(fā)生的途徑提供理論依據(jù), 并為海洋PSP污染的早期預(yù)報(bào)及監(jiān)測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

動(dòng)物取材為健康的 ICR品系成年小鼠, 體重25～30g, 由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供;標(biāo)準(zhǔn)品為膝溝藻毒素 GTX-1, 4, 購于加拿大海洋生物研究所; 雙硝基二硫代苯甲酸（DTNB, 99%）、還原型谷胱甘肽（GSH, 98%）均購于德國Merck公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將實(shí)驗(yàn)小鼠分為6組, 每組5只。采用急性暴露方式, 將GTX-1, 4標(biāo)準(zhǔn)毒素稀釋2500倍（質(zhì)量濃度為0.02483μg/mL）, 暴露組按照1μg/kg體重的劑量腹腔注射染毒, 對(duì)照組則注射等量的 HCl水溶液（pH=3）, 暴露時(shí)間分別為60、90、120 min。處死后解剖小鼠內(nèi)臟, 取出肝、腎組織塊（0.2～1.0 g）, 用生理緩沖液將組織制作成10 %勻漿液用于生化分析。測(cè)定肝腎組織中抗氧化指標(biāo)以及抗氧化酶活性。

1.3 各指標(biāo)測(cè)定[6～9]

GSH含量的測(cè)定采用 Beutler改良法; GSH-Px活力測(cè)定采用DTNB顯色法; SOD活力測(cè)定采用改良Marklund方法。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行處理, 對(duì)實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組組間差異, 利用 SPSS11.0軟件進(jìn)行t檢測(cè)和協(xié)方差分析。

2 結(jié)果

2.1 PSP對(duì)肝臟氧化損傷的影響

肝臟GSH、GSH-Px及SOD測(cè)定結(jié)果如表1所示。由表 1可以看出, 在各暴露時(shí)間點(diǎn)小鼠肝臟中GSH含量與對(duì)照組相比沒有表現(xiàn)出顯著變化（P＞0.05）; 抗氧化酶 GSH-Px、SOD活力與對(duì)照組比較均無顯著差異（P＞0.05）。協(xié)方差分析表明, 不同暴露時(shí)間下染毒組之間沒有顯著差別（P＞0.05）。

表 1 PSP對(duì)小鼠肝組織中 GSH水平及 GSH-Px、SOD活力的影響（n=5）Tab. 1 PSP affects GSH level and activities of GSH-Px and SOD in murine liver （n=5）

2.2 PSP對(duì)腎臟氧化損傷的影響

腎臟GSH、GSH-Px及SOD測(cè)定結(jié)果如表2所示。由表2可以看出, 暴露60 min時(shí)染毒組腎中GSH含量與對(duì)照組相比沒有顯著變化（P＞0.05）; 暴露90、120 min時(shí)腎中GSH含量明顯降低（P＜0.01）。協(xié)方差分析表明, 60、120 min染毒組相互之間不存在顯著差別（P＞0.05）,但 120 min染毒組明顯低于 90 min（P＜0.01）。由此可知, 腎臟中GSH的含量在染毒后呈現(xiàn)降低趨勢(shì), 并且這種趨勢(shì)具有持續(xù)性。暴露60、90、120 min染毒組腎臟中GSH-Px及SOD活力與空白組比較均無顯著變化（P＞0.05）。協(xié)方差分析表明, 染毒組三者之間沒有顯著差別（P＞0.05）。

表 2 PSP對(duì)小鼠腎組織中 GSH水平及 GSH-Px、SOD活力的影響（n=5）Tab. 2 PSP affects GSH level and activities of GSH-Px and SOD in murine kidney（n=5）

3 討論

生物體在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中, 形成了一套完整的保護(hù)體系——抗氧化系統(tǒng)來清除體內(nèi)多余的活性氧。當(dāng) ROS的生成增加時(shí), 機(jī)體會(huì)通過一定的調(diào)控系統(tǒng)增加抗氧化物質(zhì), 從而使機(jī)體增強(qiáng)對(duì)氧化損傷的抵抗能力[10]。

GSH是機(jī)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分, 它是一種低分子清除劑, 能夠清除體內(nèi)的超氧陰離子和其他氧自由基, 保護(hù)細(xì)胞完整性, 維持細(xì)胞正常代謝。細(xì)胞內(nèi)GSH的水平對(duì)維持細(xì)胞抵抗氧化損傷的能力起著重要的作用, GSH的減少意味著體內(nèi)氧化狀態(tài)的加重, 因此GSH含量的多少是衡量生物體抗氧化能力大小的重要因素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 暴露90 min后小鼠腎中GSH含量發(fā)生顯著變化（P＜0.01）并且具有持續(xù)性, 說明腎臟的抗氧化能力減弱, PSP對(duì)腎臟的氧化損傷加重。可能原因是GTX-1, 4作用于靶器官腎, 改變了其中的氧化還原狀態(tài), 誘導(dǎo)了GSH清除自由氧的過程。當(dāng)GSH消耗量過大時(shí), 必將會(huì)引發(fā)酶失活、脂質(zhì)過氧化等一系列氧化損傷。

SOD和GSH-Px是機(jī)體內(nèi)清除ROS等自由基的特異酶類, 其活力的降低提示機(jī)體內(nèi)自由基產(chǎn)生增加[11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中兩種酶類抗氧化劑SOD、GSH-Px活性均未觀察到顯著變化（P＞0.05）, 表明這兩種指標(biāo)的變化不敏感, 有可能是由于 PSP并不是直接作用于酶蛋白, 而是通過其他過程導(dǎo)致了體內(nèi)活性氧升高, 從而導(dǎo)致抗氧化劑消耗量的增加。機(jī)體內(nèi)GSH-Px的主要生物學(xué)作用是清除脂質(zhì)氫過氧化物,在病理生理情況下活性氧可能導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化, 造成生物膜損傷甚至更廣泛的組織損傷, 但是只要GSH-Px清除脂類氫過氧化物的效能不受到影響, 它對(duì)機(jī)體的損傷就可以得到減輕。實(shí)驗(yàn)中未觀察到GSH-Px活力的顯著變化, 由此推測(cè)在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)間內(nèi)肝臟和腎臟尚未發(fā)生脂類過氧化物的顯著升高,沒有超過器官中GSH-Px清除能力[12]。

有研究證明, 腎臟對(duì) PSP似乎更敏感, 一定劑量的 PSP可對(duì)腎功能造成損傷[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,腎臟中GSH含量的變化具備了敏感性和持續(xù)性, 有作為 PSP早期預(yù)測(cè)指標(biāo)的可能。本研究通過觀察氧化損傷指標(biāo)的變化, 在低劑量（1/10LD50i.p.）和短時(shí)間（120 min）時(shí)已觀察到某些指標(biāo)的顯著變化, 并且個(gè)體在這種情況下并沒有出現(xiàn)明顯的行為反應(yīng), 體現(xiàn)了這種方法的早期預(yù)警效果, 而且從實(shí)驗(yàn)操作的難易程度、費(fèi)用消耗方面都具有一定的優(yōu)勢(shì)。但是關(guān)于利用氧化損傷指標(biāo)對(duì)海洋 PSP污染進(jìn)行早期預(yù)警的可靠性, 仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

[1] 江天久, 尹伊偉, 駱育敏, 等. 廣東大亞灣和大鵬灣麻痹性貝類毒素研究[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2000, 20（4）:341-344.

[2] 鄔建勇, 王金輝, 程祥圣. 上海市海產(chǎn)品市場(chǎng)的麻痹性貝毒檢測(cè)和分析[J]. 毒理學(xué)雜志, 2006, 20（1）:52-53.

[3] 江天久, 江濤. 中國沿海部分海域麻痹性貝毒研究[J]. 海洋與湖沼, 2007, 38（1）: 36-41.

[4] 徐立紅, 張甬元, 陳宜瑜. 分子生態(tài)毒理學(xué)研究進(jìn)展及其在水環(huán)境保護(hù)中的意義[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 1995,19（2）: 171-185.

[5] 劉潔生, 劉玉榮, 聶利華, 等. 大鼠低劑量長(zhǎng)期攝入麻痹性貝毒的毒性研究[J]. 中國病理生理雜志, 2005,21（7）: 1368-1373.

[6] Cheng J P, Yang Y C, Hu W X, et al. Effect of methylmercury on some neurotransmitters and oxidative damage of rats[J]. Journal of Environmental Science,2005, 17（3）: 469-473.

[7] Cookson M R, Pentreath V W. Protective roles of glutathione in the toxicity of mercury and cadmium compounds to C6 glioma cells[J]. Toxicology in Vitro,1996, 10（3）: 257-264.

[8] Cheng J P, Hu W X, Liu X J, et al. Expression of c-fos and oxidative stress on brain of rats reared on food from mercury-selenium coexisting mining area[J].Journal of Environmental Science, 2006, 18（4）:788-792.

[9] JI X L, WANG W H, CHENG J P, et al. Free radicals and antioxidant status in rat liver after dietary exposure of environmental mercury[J]. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2006, 22: 309-314.

[10] 方允中, 鄭榮梁. 自由基生物學(xué)的理論與應(yīng)用[M].合肥: 中國科技大學(xué)出版社, 2002.

[11] 胡衛(wèi)萱, 王文華, 楊柳, 等. 腹腔注射甲基汞對(duì)大鼠腦中汞的積累及氧化性損傷[J]. 衛(wèi)生毒理學(xué)雜志,2003, 17（3）: 167-168.

[12] 劉景生. 細(xì)胞信息與調(diào)控[M]. 第2版. 北京: 中國協(xié)和大學(xué)出版社, 2004. 339-367.

Received: Dec., 9, 2008

Key words:paralytic shellfish poisoning （PSP）; oxidative stress; liver; kidney

Abstract:Oxidative stress induced by paralytic shellfish poisoning （PSP） in liver and kidney was studied by comparing mice acutely exposed to GTX-1,4. The exposure dose was 1μg/kg with different durations of 60, 90 and 120 min. The results found that the contents of GSH in liver changed slightly; in kidney, the contents of GSH were significantly decreased at 90 and 120min. The activities of GSH-Px and SOD were changed slightly in both organs （P ＞ 0.05）. These data indicate that GSH is involved in kidney injury of PSP; GSH content in kidney may be a sensitive indicator for detecting PSP.

（本文編輯:張培新）

Effects of PSP-induced oxidative stress in liver and kidney

CHEN Xue1,2, CHENG Jin-pin1, ZHANG Jian-da1, SONG Yu-ling1, WANG Wen-hua1, YU Jin-lian2
（1. School of Environmental Science and Engineering, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240,China; 2. Life and Environment Sciences College, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China）

Q179.1

A

1000-3096（2010）12-0093-03

2008-12-09;

2009-03-10

上海科委科技攻關(guān)項(xiàng)目（08dz1206302）

陳雪（1983-）, 女, 安徽合肥人, 碩士, 主要從事海洋環(huán)境

領(lǐng)域的研究, 電話: 021-54742823; 通信作者, 程金平, 副教授, 電話:021-54742823, 13916873206, E-mail: jpcheng@sjtu.edu.cn