呂洛堂 黃華健 張 丹

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)屬嗜肝DNA病毒科，基因組長(zhǎng)約3.2kb，為部分雙鏈環(huán)狀DNA。長(zhǎng)鏈為負(fù)鏈，位置和長(zhǎng)度相對(duì)固定。短鏈為正鏈，其長(zhǎng)度可變，約為負(fù)鏈的50%～80%。HBV主要引起急、慢性肝炎、肝硬化和肝癌，其基因序列高度變異。1988年Okamoto等[1]根據(jù)不同基因型之間的差異＞8%，將HBV DNA分為A～D4型，初步建立了乙型肝炎病毒基因分型標(biāo)準(zhǔn)。Naito等[2]基于HBV preS1至S基因建立了型特異性引物PCR分型法，該方法可以精確地確定A～F六個(gè)HBV基因型，不僅特異性高，而且快捷、方便。既往流行病學(xué)調(diào)查表明HBV基因型呈一定的地理區(qū)域分布[3-5]。湖南邵陽(yáng)地區(qū)HBV基因型分布如何，有待于研究。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 168例慢性HBV感染者為湖南省邵陽(yáng)市中心醫(yī)院和新寧縣回龍鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院門診和住院患者，其中慢性無(wú)癥狀HBV攜帶者(chronic asymptomatic HBV carrier，AsC)79例、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)68例、肝硬化(liver Cirrhosis，LC)21例。男105例，女63例，年齡13～76歲，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2000年第十次全國(guó)傳染病與寄生蟲病學(xué)會(huì)和肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的病毒性肝炎防治方案。所有患者均排除了丙型肝炎病毒感染及其他能導(dǎo)致肝臟病變的疾病。所有血清標(biāo)本經(jīng)檢測(cè)HBV血清學(xué)標(biāo)志物后，貯存于-70℃待檢。

1.2 主要試劑 血清DNA抽提試劑盒，購(gòu)自上海科華生物科技有限公司；PCR擴(kuò)增試劑(2×pfu MasterMix)、D2000 Marker購(gòu)自北京天根生物科技有限公司。

1.3 血清DNA提取 按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，采用濃縮裂解法，稍做改動(dòng)。操作步驟簡(jiǎn)述如下：取50μL濃縮液加到0.5mL離心管中，再加入待測(cè)血清50μL，振蕩混勻后靜置2min，8000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄上清。加入10μL裂解液，劇烈振蕩至無(wú)沉淀后短暫離心，沸水浴10min，14000轉(zhuǎn)/min離心15min，取上清液2μL為模板做PCR反應(yīng)。

1.4 HBV基因型的檢測(cè) 采用型特異性引物分型法。按照文獻(xiàn)[6]介紹的方法進(jìn)行。引物序列見(jiàn)表1，由上海生工生物科技有限公司合成。首先用外引物P1與P2進(jìn)行第一輪PCR，反應(yīng)體系為：引物P1(10μm)和P2(10μm)各0.5μL，2×Pfu MasterMix 12.5μL，模板1μL，ddH2O 10.5μL，總體積25μL。將上述組分混勻后，加40μL石蠟油覆蓋液面。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)后72℃再延伸5min。同時(shí)以ddH2O作為陰性對(duì)照。然后以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，分別以A組引物(B2、BA1R、BB1R、BC1R)和B組引物(B2R、BD1、BE1、BF1)為內(nèi)引物進(jìn)行第二輪PCR，檢測(cè)HBV基因型A、B、C和D、E、F。PCR反應(yīng)體系中除引物外，其余成分同第一輪，同時(shí)以ddH2O作為陰性對(duì)照。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)后72℃再延伸10min。最后將兩組第二輪PCR產(chǎn)物分別在30g/L瓊脂糖中進(jìn)行電泳，同時(shí)加入分子量Marker(D2000)，在紫外光下通過(guò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段的大小來(lái)判斷基因型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 兩個(gè)樣本構(gòu)成比的比較采用x2檢驗(yàn)，P 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

對(duì)邵陽(yáng)地區(qū)168例不同臨床類型的慢性HBV感染者進(jìn)行基因分型，可檢出B型、C型、混合型B+C和混合型B+D，分別占51.2%、42.2%、5.4%和1.2%，未發(fā)現(xiàn)A型、E型和F型。各臨床類型HBV基因型構(gòu)成比見(jiàn)表2。慢性無(wú)癥狀HBV攜帶者與慢性乙型肝炎相比，HBV基因型構(gòu)成比無(wú)顯著性差異(x2＝0.12，P＞0.05)。肝硬化患者HBV基因型與慢性無(wú)癥狀HBV攜帶者或慢性乙型肝炎相比，C基因型所占比例較高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組之間基因型構(gòu)成比無(wú)顯著性差異(x2＝4.63或3.61，P＞0.05)。

表1 巢式PCR HBV基因分型所用引物序列

表2 168例慢性HBV感染者血清HBV基因型分布[例(%)]

3 討論

我國(guó)屬HBV感染高流行區(qū)，流行病學(xué)調(diào)查表明HBV基因型呈一定的地理區(qū)域分布。在我國(guó)，HBV基因型主要是B型和C型， 但二者的分布也存在一定的地域差異[7-11]，南方以B型為主，北方以C型為主；A型和D型在多數(shù)地區(qū)也占有一定比例，目前尚未發(fā)現(xiàn)E型和F型。目前認(rèn)為，不同地區(qū)優(yōu)勢(shì)基因型反映了HBV自然感染史發(fā)生的變異特點(diǎn)，是病毒變異后進(jìn)化的結(jié)果。肖揚(yáng)等[7]對(duì)浙江溫州地區(qū)966例患者進(jìn)行HBV基因分型發(fā)現(xiàn)，66.46%為C型，20.49%為B型，11.08%為混合型B+C。高俊薇等[12]對(duì)北京、長(zhǎng)春、漢川、深圳、清遠(yuǎn)和南京等11個(gè)城市的1214例HBV DNA陽(yáng)性的慢性HBV感染者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，0.7%為A型，58.4%為C型，28.4%為B型，12.4%為混合型B+C，未發(fā)現(xiàn)有D、E、F型。北方地區(qū)(長(zhǎng)春、北京、石家莊)慢性HBV感染者中C基因型比較高，分別為58.2%、67.5%和63.6%，山東省聊城和濟(jì)南市的C基因型高達(dá)90.2%和87.9%。隨著地理位置南移，B基因型的比例逐漸增高，廣東省清遠(yuǎn)和深圳市的B基因型比例分別為7.14%和63.6%。本研究慢性HBV感染者血清中，B型占51.2%，C型占42.2%，混合型B+C占5.4%，混合型B+D占1.2%，未發(fā)現(xiàn)A型、E型和F型。表明湖南邵陽(yáng)HBV基因型仍以B型和C型為主。

目前研究發(fā)現(xiàn)，HBV基因型與臨床表現(xiàn)、預(yù)后、治療應(yīng)答均有一定關(guān)系，不同基因型具有不同的致病性。Kao等[13]的研究結(jié)果提示，隨著疾病嚴(yán)重程度的增加，C型所占的比例升高，而B型所占比例降低，C型與較為嚴(yán)重的肝臟疾病有關(guān)。本研究表明，肝硬化患者主要以C型感染為主、其次為B型。C基因型在肝硬化患者中所占的比例較高，但與慢性無(wú)癥狀HBV攜帶者或慢性乙型肝炎相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

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