楊菁菁, 孫鐵英, 胡云建

銅綠假單胞菌是引起醫(yī)院獲得性肺炎的最常見的病原菌之一。近年來,隨著各種廣譜抗菌藥物、激素、免疫抑制劑及抗腫瘤藥物等在臨床上的廣泛應(yīng)用,及氣管插管、氣管切開、導(dǎo)管留置等有創(chuàng)檢查或治療手段的應(yīng)用不斷增加,泛耐藥的銅綠假單胞菌(pan-drug resistant Pseudomonasaeruginosa,PDRPA)比率不斷上升。據(jù)我國(guó)2007年CHINET銅綠假單胞菌耐藥性監(jiān)測(cè)顯示PDRPA檢出率為3.2%[1]。PDRPA引起的相關(guān)感染正逐漸成為臨床抗感染治療的難題。在目前臨床的藥敏試驗(yàn)中,針對(duì)銅綠假單胞菌的藥敏試驗(yàn)多數(shù)為單藥制劑(少數(shù)為β內(nèi)酰胺類抗生素與酶抑制劑的復(fù)合制劑),聯(lián)合用藥對(duì)PDRPA的體外研究較少。近年來國(guó)外研究建立抗菌藥物聯(lián)合殺菌試驗(yàn)(multiple combination bactericidal antibiotic test,MCBT)的方法[2],針對(duì)囊性纖維化患者的PDRPA展開研究,比較單藥治療及優(yōu)化抗菌藥物組合,并且探討MCBT指導(dǎo)下的抗菌治療對(duì)臨床的意義。本研究采用MCBT方法,選擇急性呼吸道感染中的PDRPA,探討體外聯(lián)合抗感染治療的意義。

材料與方法

一、材料

(一)菌株來源、鑒定及藥敏試驗(yàn) 收集2009年1月1日至2010年1月31日期間北京醫(yī)院臨床分離的20株P(guān)DRPA,菌株均采自痰或呼吸道分泌物標(biāo)本。PDRPA：參照文獻(xiàn)[3],對(duì)臨床檢測(cè)的青霉素/酶抑制劑、頭孢菌素、碳青霉烯類、氟喹諾酮類及氨基糖苷類等抗菌藥物均耐藥的銅綠假單胞菌。同一患者的不同時(shí)間留取的菌株,僅取第1次分離菌株。

細(xì)菌鑒定采用VIT EK 2 COMPACT自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行菌株鑒定,藥敏試驗(yàn)采用K-B法初篩,按CLSI標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853。

(二)抗菌藥物的標(biāo)準(zhǔn)品和培養(yǎng)基

1.抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品：選擇對(duì)銅綠假單胞菌有殺菌或抑菌作用的抗菌藥物共11種,其中殺菌劑9種(多黏菌素 B、哌拉西林-他唑巴坦、頭孢他啶、氨曲南、亞胺培南、美羅培南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星),抑菌劑2種(米諾環(huán)素及阿奇霉素)。多黏菌素B購(gòu)于Sigma-Aldrich公司(No.P4932),頭孢他啶與亞胺培南購(gòu)自市售藥品(商品名分別為凱復(fù)定與泰能,純度分別為99%、99.5%),其余藥物標(biāo)準(zhǔn)品與對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所技術(shù)服務(wù)部。

2.抗菌藥物紙片：頭孢他啶、頭孢吡肟、哌拉西林-他唑巴坦、亞胺培南、美羅培南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和阿米卡星等抗菌藥物紙片均為OXOID公司產(chǎn)品。

3.培養(yǎng)基：大豆胰蛋白胨肉湯培養(yǎng)基(TSB)、Mueller Hinton(MH)肉湯培養(yǎng)基購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所技術(shù)服務(wù)部。陽(yáng)離子調(diào)節(jié)的MH培養(yǎng)基(CAMHB)配制：按照MH肉湯培養(yǎng)基的使用說明,以25 g MH肉湯培養(yǎng)基粉末∶1 L雙蒸水的比例,并添加氯化鈣與氯化鎂,使鈣離子與鎂離子終濃度均為25 mg/L,即形成CAMHB。CaCl2貯存液配制：CaCl2?2H2O 3.68 g溶于100 mL蒸餾水中,即為含鈣離子10 mg/mL貯存液。MgCl2貯存液配制：MgCl2?6H2O 8.36 g,溶于 100 mL蒸餾水中,即為含鎂離子10 mg/mL貯存液。將氯化鈣與氯化鎂儲(chǔ)存液校正pH至7.2±0.1,121℃滅菌15 min,備用,以配制CAMHB。

二、方法

(一)最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測(cè)定 受試菌株的MIC及MBC測(cè)定,按照CLSI指南中推薦的微量肉湯稀釋法,在除外米諾環(huán)素及阿奇霉素的9種殺菌劑中進(jìn)行。以微量肉湯稀釋法培養(yǎng)24 h后,未見細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物最低濃度為MIC;從96孔板中未見細(xì)菌生長(zhǎng)的各孔中吸取10 μ L培養(yǎng)液涂布于瓊脂平皿表面,35℃再培養(yǎng)24 h,能使原接種物菌量降低3 log的最低抗菌藥物濃度為MBC。

(二)MCBT

1.方法設(shè)計(jì)：參照文獻(xiàn)[2],MCBT在96孔微孔板中進(jìn)行。制備各抗菌藥物儲(chǔ)液分裝凍存于-80℃冰箱,實(shí)驗(yàn)當(dāng)日制備10倍試驗(yàn)濃度的抗菌藥物工作液。聯(lián)合的2種抗菌藥物各取10 μ L工作液加入同一微孔。細(xì)菌在MH瓊脂平皿上孵育過夜后,再挑取3～6個(gè)菌落至大豆胰蛋白胨肉湯培養(yǎng)基(TSB)中再培養(yǎng)4～6 h,將0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝坏膶?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌,以TSB稀釋100倍,每孔加入上述微生物培養(yǎng)液80 μ L,使每孔終濃度約為 5×105CFU/mL。以細(xì)菌生長(zhǎng)孔(無抗生素)和無菌孔(無細(xì)菌接種物)作對(duì)照。96孔板置于35℃。觀察24 h和48 h的細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)。48 h后,于未見細(xì)菌生長(zhǎng)的孔中吸取10 μ L懸液置于5%血瓊脂平皿上,35℃培養(yǎng)24 h后,能使原接種物菌量降低3log的抗菌藥物聯(lián)合,被認(rèn)為該組抗菌藥物聯(lián)合具有殺菌活性。實(shí)驗(yàn)在不同日重復(fù)3次。

2.藥物濃度：主要依照藥物在單次靜脈或口服給藥后可達(dá)到的平均血清藥物濃度水平作為藥物濃度選擇的上限[2]。部分藥物(多黏菌素B、阿米卡星)對(duì)檢測(cè)的泛耐藥菌株取各自敏感性折點(diǎn)為MCBT使用的藥物濃度。MCBT中各藥物濃度與對(duì)應(yīng)的2008年CLSI中銅綠假單胞菌折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系見表1。

3.名詞定義：參照文獻(xiàn)[4],本研究中“殺菌作用”、“無殺菌作用”及“拮抗作用”定義如下。①殺菌作用：在抗菌藥物存在的情況下,肉眼無混濁的微孔中傳代后仍無細(xì)菌生長(zhǎng)。②無殺菌作用：抗菌藥物存在的情況下,微孔混濁或傳代后出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。③拮抗作用：新加入的抗菌藥物與原可殺菌的抗菌藥物組合后出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。討論中為比較棋盤法時(shí),提及的“協(xié)同”、“相加”、“無意義”和“拮抗”按照棋盤法中計(jì)算的部分抑菌指數(shù)劃分。

(三)數(shù)據(jù)的處理與分析 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。組間比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 MCBT中藥物濃度與2008年CLSI銅綠假單胞菌折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系Table 1.Antibiotic concentrations used in MCBT and corresponding 2008 CLSI breakpoints for P.aeruginosa

結(jié) 果

一、微量肉湯稀釋法測(cè)定 PDRPA的 MIC及MBC

臨床分離20株銅綠假單胞菌對(duì)頭孢他啶等8種抗菌藥物的紙片法藥敏試驗(yàn)均呈耐藥,顯示為PDRPA。對(duì)該20株P(guān)DRPA通過微量肉湯稀釋法測(cè)定MIC與MBC值,見表2。20株P(guān)DRPA對(duì)多黏菌素 B敏感(MIC≤2 mg/L),但對(duì)阿米卡星(MIC≥64 mg/L)、哌拉西林-他唑巴坦(MIC≥128 mg/L)、頭孢他啶(MIC≥32 mg/L)、氨曲南(MIC≥32 mg/L)、亞胺培南(MIC≥16 mg/L)、美羅培南(MIC≥16 mg/L)、左氧氟沙星(MIC≥8 mg/L)和環(huán)丙沙星(MIC≥4 mg/L)均顯示耐藥。

表2 抗菌藥物對(duì)PDRPA的MIC及M BC測(cè)定(微量肉湯稀釋法)(mg/L)Table 2.Susceptibility of pan-drug resistant Pseudomonas aeruginosa to single antibiotics(mg/L)

二 、PDRPA 的 MCBT

(一)MCBT中單藥對(duì)PDRPA菌株的抑菌作用與殺菌作用 在MCBT的96孔板中,MCBT中單藥濃度與上文微量肉湯稀釋法所測(cè)得的各抗菌藥物的MIC相比較,基本保持一致。多黏菌素B單藥2 mg/L對(duì)19株細(xì)菌可達(dá)到殺菌作用,其中頭孢他啶單藥32 mg/L對(duì)5株細(xì)菌可達(dá)到殺菌作用,氨曲南單藥32 mg/L對(duì)2株菌可達(dá)到殺菌作用。其余各抗菌藥物MCBT設(shè)定的單藥濃度對(duì)所有菌株均無抑菌作用及殺菌作用。

(二)MCBT中產(chǎn)生殺菌作用的抗菌藥物聯(lián)合各菌株在96孔板中進(jìn)行11種抗菌藥物54組聯(lián)合藥敏試驗(yàn)。多黏菌素B與其他10種抗菌藥物的相應(yīng)聯(lián)合的殺菌作用達(dá)到100%,未發(fā)現(xiàn)拮抗作用。其余抗菌藥物聯(lián)合的殺菌作用見表3。其中,因頭孢他啶與氨曲南的各自單藥濃度分別對(duì)5株菌與2株菌可達(dá)到殺菌作用,計(jì)算中分為達(dá)到殺菌作用的總菌株數(shù)與聯(lián)合用藥后產(chǎn)生殺菌作用的菌株數(shù)。

(三)MCBT中產(chǎn)生拮抗作用的抗菌藥物聯(lián)合在MCBT中的頭孢他啶、氨曲南的藥物選擇濃度下,各自對(duì)應(yīng)5株、2株細(xì)菌在單藥下可達(dá)到殺菌作用。原對(duì)頭孢他啶單藥敏感的5株P(guān)DRPA,在阿奇霉素聯(lián)合頭孢他啶中產(chǎn)生拮抗作用;原對(duì)氨曲南單藥敏感的5株P(guān)DRPA,在阿奇霉素聯(lián)合氨曲南中亦均產(chǎn)生拮抗作用。

表3 抗菌藥物組合的殺菌活性Table 3.Bactericidal activity of antimicrobial agent combination against pan-drug resistant Pseudomonasaeruginosa isolates

討 論

近年來,國(guó)際范圍內(nèi)銅綠假單胞菌耐藥的程度逐漸增加[10],不僅出現(xiàn)多重耐藥銅綠假單胞菌(multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa,MDRPA),超級(jí)耐藥銅綠假單胞菌(extensive drug resistantPseudomonasaeruginosa,XDRPA)、PDRPA也不斷增加。PDRPA引起的急性感染通常導(dǎo)致臨床預(yù)后極差,是臨床抗感染治療面臨的難題之一。針對(duì)此類菌株的感染,MCBT可協(xié)助篩選出相對(duì)適合的藥物聯(lián)合對(duì)細(xì)菌進(jìn)行清除,通過較短時(shí)間(細(xì)菌分離、藥敏試驗(yàn)后48～72 h),測(cè)定多種抗菌藥物聯(lián)合治療的體外敏感性[4]。相比常規(guī)的單一抗菌藥藥敏試驗(yàn),MCBT的結(jié)果對(duì)臨床治療急性MDRPA、PDRPA的感染,可能有更好的臨床指導(dǎo)意義。

本研究中,我院臨床分離的20株P(guān)DRPA菌株均對(duì)多黏菌素敏感(MIC≤2 mg/L),95%菌株的MBC未超過2 mg/L。這表明多黏菌素是體外對(duì)PDRPA最有效的抗感染藥之一,與文獻(xiàn)報(bào)道的基本相似[11]。多黏菌素為多黏類芽孢桿菌分離的脂肽類抗菌藥物,為環(huán)狀陽(yáng)離子多肽抗生素,通過破壞細(xì)胞外膜磷脂,導(dǎo)致細(xì)胞通透性增高和細(xì)胞死亡[12]。但有研究觀察,在單獨(dú)使用多黏菌素治療數(shù)天內(nèi)可逐漸發(fā)生耐藥甚至產(chǎn)生不良反應(yīng),更適合與其他抗菌藥物聯(lián)用[5]。因研究選擇的PDRPA菌株對(duì)多黏菌素單藥敏感,其聯(lián)合用藥的協(xié)同作用難以評(píng)估;而在部分文獻(xiàn)中報(bào)道,多黏菌素與阿奇霉素、亞胺培南、利福平等藥物有一定的協(xié)同作用[9]。

本研究顯示,阿米卡星聯(lián)合氨曲南、頭孢他啶、哌拉西林-他唑巴坦、美羅培南等,可對(duì)實(shí)驗(yàn)中部分PDRPA菌株達(dá)到殺菌作用,是本實(shí)驗(yàn)中最有效的抗菌藥物組合;與多個(gè)相關(guān)研究結(jié)果相似[13-15]。而預(yù)期喹諾酮類藥物(左氧氟沙星、環(huán)丙沙星)可與β內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生類似殺菌作用,但僅對(duì)實(shí)驗(yàn)中1～2株菌株起到了殺菌作用;而未預(yù)計(jì)到的2種β內(nèi)酰胺類抗生素的聯(lián)合卻表現(xiàn)出對(duì)部分菌株的殺菌作用：頭孢他啶聯(lián)合氨曲南、頭孢他啶聯(lián)合哌拉西林-他唑巴坦、哌拉西林-他唑巴坦聯(lián)合美羅培南。盡管體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,氨基糖苷類和β內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合可能是治療PDRPA最有效的聯(lián)合之一,但實(shí)際在臨床中,PDRPA引起的急性感染非常棘手,尤其在面臨高齡患者、多臟器功能不全、免疫功能低下及并發(fā)感染中毒性休克等綜合因素的限制時(shí),氨基糖苷類抗生素的不良反應(yīng)使其臨床使用十分有限。有大規(guī)模研究比較β內(nèi)酰胺類單藥與氨基糖苷類聯(lián)合β內(nèi)酰胺類抗生素在感染性休克患者中的療效,兩者耐藥率相似但聯(lián)合用藥的不良反應(yīng)增加,不推薦感染性休克中聯(lián)合使用氨基糖苷類抗生素[16]。而依照本實(shí)驗(yàn)MCBT結(jié)果,在部分菌株中,2種β內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合的殺菌作用接近氨基糖苷類和β內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合的水平。與此相似,Song等[17]應(yīng)用棋盤法檢測(cè)藥物聯(lián)合的有效性,亦支持頭孢他啶聯(lián)合氨曲南或頭孢吡肟聯(lián)合氨曲南等對(duì)部分銅綠假單胞菌有協(xié)同作用。2種β內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用產(chǎn)生殺菌作用,而相對(duì)不良反應(yīng)小,可能對(duì)臨床用藥有一定的提示,但需說明,體內(nèi)外存在差異,其是否發(fā)揮相似的殺菌作用,以及有無不良反應(yīng)的發(fā)生等,可能需要更多的臨床數(shù)據(jù)來闡述。

此外,從上述MCBT的結(jié)果(表3)中比較2種碳青霉烯類抗生素(美羅培南與亞胺培南)在PDRPA中的差異：雖然兩者所取的濃度一致(8 mg/L),各自單藥均不能抑制所有20株細(xì)菌生長(zhǎng);但美羅培南聯(lián)合阿米卡星、哌拉西林-他唑巴坦等藥物時(shí),均比亞胺培南聯(lián)合上述藥物時(shí),對(duì)更多的菌株產(chǎn)生殺菌活性。這提示在我院的PDRPA菌株中,選擇碳青霉烯類抗生素聯(lián)合其他藥物治療時(shí),美羅培南可能更有優(yōu)勢(shì)。

與棋盤法相比,MCBT沒有棋盤法的濃度梯度,因此不能計(jì)算部分抑菌指數(shù)(FIC),不能將藥物組合的有效性細(xì)致地劃分為協(xié)同、相加、無意義及拮抗。但MCBT有更多的優(yōu)勢(shì)：它能同時(shí)進(jìn)行10余種藥物之間任意2種或2種以上抗菌藥物的聯(lián)合,完成棋盤法難以達(dá)到的多種藥物的組合數(shù)量,并且因所設(shè)計(jì)的濃度參照最高平均血清藥物濃度,可根據(jù)結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥;避免了在棋盤法中MIC值高于血清最高血藥濃度的藥物聯(lián)合,即使存在協(xié)同或相加效應(yīng),而難以應(yīng)用的情況。

面對(duì)PDRPA急性感染時(shí),因不同菌株耐藥機(jī)制的差異,選擇個(gè)體化的MCBT較單藥的敏感性試驗(yàn)和棋盤法更能幫助聯(lián)合抗菌藥物的選擇。本研究中阿米卡星與β內(nèi)酰胺類抗生素的聯(lián)合、2種β內(nèi)酰胺類抗生素的聯(lián)合顯示出對(duì)部分菌株的殺菌作用增強(qiáng),可能有助于在臨床中抗菌藥物聯(lián)合用藥的選擇。MCBT與臨床抗感染治療關(guān)系的探討還需要進(jìn)一步觀察研究。

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