詹自力 茍欣

細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白P27和細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)在哺乳動(dòng)物有絲分裂G1期轉(zhuǎn)化到S期中起著重要調(diào)節(jié)作用，已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在消化系腫瘤、乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤中都存在P27的降低以及cyclin D1升高的現(xiàn)象。我們應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)P27和cyclinD1在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，對(duì)P27、cyclin D1與腫瘤分期分級(jí)的關(guān)系，以及兩種蛋白在膀胱癌中表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行了探討，現(xiàn)將有關(guān)資料報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇1992～2000年期間在我院施行膀胱部分切除術(shù)和全膀胱切除術(shù)，并經(jīng)病理證實(shí)為膀胱移行細(xì)胞癌的石蠟標(biāo)本65例，年齡32～82歲，平均65歲，男、女比例為5.5:1。非典型增生10例，年齡45～70歲，平均61歲，正常膀胱組織8例，年齡64～72歲，平均69歲。臨床分期按TNM標(biāo)準(zhǔn)分為淺表性腫瘤Ta-T1：37例；侵潤(rùn)性腫瘤T2-T4：28例。病理分級(jí)按WHO法：I級(jí)20例，II級(jí)26例，III級(jí)19例。

1.2 方法 所用鼠抗人P27和cyclin D1單克隆抗體，以及SP免疫組化試劑盒均購(gòu)自福州邁新公司。采用免疫組織化學(xué)染色SP法。石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水，0.3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶30min，10%正常山羊血清封閉非特異性背景30min，依次加入一抗(鼠抗人P27、cyclin D1單克隆抗體，4℃過夜)，二抗(生物素化免抗鼠IgG，30min)，鏈霉素親生物素蛋白過氧化酶10min，以上各步間均PBS緩沖液沖洗3次。DAB顯色蘇本素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明封片。以已知P27和cyclin D1表達(dá)陽性的胃癌標(biāo)本作為陽性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。用高倍鏡(10×40)計(jì)數(shù)10個(gè)視野，P27以大于50%的陽性細(xì)胞定為陽性[1]，陽性細(xì)胞數(shù)≤50%為陰性；cyclin D1以陽性細(xì)胞數(shù)＞5%定為陽性，陽性細(xì)胞數(shù)≤5%定為陰性[2]。采用雙盲法閱片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用x2檢驗(yàn)及精確概率法分析組間差異，Spearman相關(guān)分析兩者相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1P27在膀胱癌，非典型增生和正常膀胱組織中的表達(dá) 正常膀胱組織P27陽性表達(dá)率為100%，顯色位于細(xì)胞核；非典型增生標(biāo)本中，P27陽性表達(dá)率為60%。在非典型增生組織中P27明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=4.114，P＜0.05)；膀胱癌組織中P27陽性表達(dá)率僅為52.3%，明顯低于正常膀胱組織(x2=6.632，P＜0.01)。

2.2P27表達(dá)與膀胱癌分級(jí)分期的關(guān)系 I、II、III級(jí)膀胱癌標(biāo)本P27陽性表達(dá)率分別為75%、53.8%、26.3%，三組間相比較，差別均有顯著性意義(x2=7.603，P＜0.05)。應(yīng)用x2分割法進(jìn)一步比較每?jī)山M之間P27陽性表達(dá)水平的差別，I級(jí)與III級(jí)比較，有顯著性意義(P＜0.01)。I級(jí)組與II級(jí)組、II級(jí)組與III級(jí)組相比較，無顯著性差異(P＞0.05)。淺表組與侵潤(rùn)組相比較，有顯著性差異(P＜0.01)。

2.3 cyclin D1在膀胱癌，非典型增生和正常膀胱組織中的表達(dá) cyclin D1在正常膀胱組織中無陽性表達(dá)，在非典型增生中的陽性表達(dá)率為40%，明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。膀胱癌中陽性表達(dá)率為38.5%，與正常組織相比，有顯著性意義。

2.4 cyclin D1與膀胱癌分級(jí)分期的關(guān)系 I、II、III級(jí)膀胱癌cyclin D1陽性表達(dá)率為65%、34.6%、15.8%，三組間比較差別有顯著性意義(x2=10.24,P＜0.01)。其中G1組與G2組(x2=4.182,P＜0.05)、G1組與G3組比較(x2=9.753,P＜0.01)，有顯著性意義。G2組與G3組相比較，無顯著性差異(x2=1.99,P＞0.1)。淺表組(Ta-T1)與侵潤(rùn)組(T2-T4)相比較，有顯著性差異(x2=8.823，P＜0.01)。

2.5P27、cyclin D1在膀胱癌組織表達(dá)的相關(guān)性 本組65例膀胱癌中P27和cyclin D1同時(shí)表達(dá)陽性22例，占P27陽性的64.7%；P27和 cyclin D1同時(shí)表達(dá)陰性28例，占P27陰性的90.3%；P27表達(dá)陽性而 cyclin D1表達(dá)陰性12例，占35.3%，P27表達(dá)陰性而 cyclin D1表達(dá)陽性3例，占9.7%，P27與cyclin D1表達(dá)間呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.565，P＜0.01)。

表1 P27、 cyclin D1在正常膀胱粘膜、非典型增生、膀胱癌表達(dá)

表2 65例膀胱癌P27 cyclin D1的表達(dá)與病理分級(jí)的關(guān)系

表3 65例膀胱癌P27 cyclin D1的表達(dá)與臨床分期的關(guān)系

表4 膀胱癌中P27、 cyclin D1表達(dá)間的關(guān)系

3 討論

3.1P27在膀胱移行細(xì)胞癌中表達(dá)的意義P27是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白家族成員之一，在細(xì)胞周期增殖和分化調(diào)控中起著非常重要的作用，是一種重要的腫瘤抑制基因。P27位于染色體12q13上，由198個(gè)氨基酸的殘基組成[3]，在細(xì)胞增殖過程的G1/S轉(zhuǎn)換中發(fā)揮作用,它可以特異性結(jié)合cyclinD-cdk4(cdk6)、cyclinA-cdk2及cyclinE2-cdk2等在S期具有活性的細(xì)胞周期素復(fù)合物及其單體,抑制cyclin/cdk復(fù)合物的活性,阻滯rb蛋白的磷酸化，對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[4]。研究發(fā)現(xiàn)P27蛋白主要定位于細(xì)胞核，Surendra等[5]則發(fā)現(xiàn)P27在細(xì)胞核和胞漿中都有表達(dá)，而定位于胞核的P27抑制腫瘤的活性高。lindberg等[6]的研究發(fā)現(xiàn)P27基因突變?cè)谀[瘤的發(fā)生過程中是稀有事件,P27與腫瘤的關(guān)系主要體現(xiàn)在其蛋白水平上,表現(xiàn)為P27蛋白的減少或缺失。P27蛋白的下降，降低了P27對(duì)正性細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的抑制效應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞增殖過度,發(fā)生腫瘤[7]。本研究發(fā)現(xiàn)在膀胱癌組織P27的陽性表達(dá)率(51%)，非典型增生組織中陽性表達(dá)率(60%)，明顯低于正常膀胱組織(100%)，表明P27的低表達(dá)可能與膀胱癌發(fā)生有關(guān)。本組資料還顯示病理III級(jí)的膀胱癌組織中P27的陽性表達(dá)率為26.3%，明顯低于I級(jí)組的75%。同時(shí)侵潤(rùn)組陽性表達(dá)率(25%)也明顯低于非侵潤(rùn)組(73%，P＜0.01)。這表明P27蛋白的表達(dá)程度與膀胱癌的惡性程度高低以及侵潤(rùn)性有關(guān)。

3.2 cyclin D1在膀胱移行細(xì)胞癌中表達(dá)的意義 cyclin D1是由位于11q13的CCND1基因編碼的蛋白,由295個(gè)氨基酸組成,其相對(duì)分子量為34×103, cyclin D1的主要功能是促進(jìn)細(xì)胞增殖，它在細(xì)胞周期中首先被合成，并在G1中期合成達(dá)高峰，與CDK4、CDK6結(jié)合形成二元復(fù)合物，使pRb蛋白磷酸化[8],pRb一旦磷酸化，其結(jié)合E2F的作用喪失，它激活細(xì)胞進(jìn)入S期所需要的一些功能因子，使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，開始DNA的合成，細(xì)胞進(jìn)入增殖狀態(tài)[9]。研究發(fā)現(xiàn)肺非小細(xì)胞癌中cyclinD1常過表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期啟動(dòng)異常,引起細(xì)胞持續(xù)性惡性增殖[10]。wang等[11]的研究表明cyclinD1與肺非小細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)，認(rèn)為cyclinD1是腫瘤發(fā)生的晚期事件，可以作為判斷肺非小細(xì)胞癌的預(yù)后指標(biāo)之一。本研究發(fā)現(xiàn)cyclin D1在正常組織無表達(dá)，在10例膀胱非典型增生組織中，有4例cyclin D1陽性表達(dá)(40%)，與正常膀胱粘膜相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在65例膀胱癌中25例陽性表達(dá)(38.5%)，與正常膀胱粘膜相比，有顯著性意義。這表明cyclin D1的過表達(dá)在膀胱粘膜增生的初期將發(fā)揮作用，這與Ogawa等的實(shí)驗(yàn)結(jié)論相同，他用尿嘧啶喂養(yǎng)小鼠4周以促進(jìn)膀胱粘膜增生，從乳頭狀增生的膀胱粘膜中發(fā)現(xiàn)：cyclin D1明顯高于對(duì)照組[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)， cyclin D1在膀胱癌G1、G2、G3組表達(dá)率分別為65%、34.6%、15.8%，依次遞減，特別在G2和G3組出現(xiàn)明顯下降，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性意義。其中，G1組與G2組間、G1組與G3組比較，有顯著性意義，G2組與G3組間相比較，無顯著性差異。淺表組(54.1%)與侵潤(rùn)組(17.5%)相比較，有顯著性差異。這表明cyclin D1在細(xì)胞癌變的初始間段將發(fā)揮其促使細(xì)胞增殖的作用，但并不參與腫瘤的侵潤(rùn)和發(fā)展。

3.3P27和cyclin D1在膀胱癌中表達(dá)的相關(guān)性 cyclin D1是作用于G1期的重要細(xì)胞周期蛋白，在G1期與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)形成復(fù)合物，P27能夠阻止cyclin D1與CDK4/CDK6結(jié)合，抑制cyclin D1-CDK4/CDK6的活性，使細(xì)胞不能進(jìn)入S期，而cyclin D1則通過cyclin D1-CDK4/CDK6磷酸化P27調(diào)節(jié)其濃度。在結(jié)腸癌，食道癌等腫瘤中，隨著腫瘤分級(jí)分期的增高，均出現(xiàn)P27的降低和cyclin D1的升高。而本實(shí)驗(yàn)顯示：在P27表達(dá)陽性的34例膀胱癌標(biāo)本中，有22例cyclin D1同時(shí)表達(dá)陽性；31例P27表達(dá)陰性標(biāo)本中，28例cyclin D1同時(shí)表達(dá)陰性，二者表達(dá)符合率為65%，二者呈正相關(guān)(r=0.23，P＜0.01)，并且膀胱癌中隨著腫瘤分級(jí)分期的升高，P27，cyclin D1表達(dá)均呈現(xiàn)同時(shí)下降趨勢(shì)。P27陽性率與cyclin D1陽性率相比較，符合P27與cyclin D1-CDK4/CDK6結(jié)合發(fā)揮其調(diào)控細(xì)胞周期作用的學(xué)說。我們認(rèn)為在膀胱癌發(fā)生的早期，pRb被內(nèi)cyclin D1-CDK4/CDK6磷酸化后，解除對(duì)轉(zhuǎn)錄因子E2F釋放的抑制效應(yīng)，釋放大量E2F，并產(chǎn)生一些功能因子，使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。此后cyclin D1在增殖中的作用已不大。由此可以看出膀胱癌P27、cyclin D1表達(dá)同時(shí)降低提示膀胱癌分化程度降低和侵潤(rùn)性的增高。

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