文件編號(hào)：1003—7586(2010)04—0059—02

血紅蛋白的提取和分離一般步驟為樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。

1 樣品處理

1.1 紅細(xì)胞的洗滌

洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白，采集的血樣要及時(shí)采用低速短時(shí)間離心分離紅細(xì)胞，然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水，緩慢攪拌10min，低速短時(shí)間離心，如此重復(fù)洗滌3次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。

1.2 血紅蛋白的釋放

在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白，加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。

2 粗分離

2.1 分離血紅蛋白溶液

將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為4層。第1層為無色透明的甲苯層，第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層，第3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。

2.2 透析

取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量濃度為20mmol／L的磷酸緩沖液中，透析12h。透析可以去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)。

3 純化

利用凝膠色譜柱可對(duì)血紅蛋白進(jìn)行純化(圖1)。

4 純度鑒定

使用最多的是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。

5 血紅蛋白的提取和分離操作問題分析

5.1 血紅蛋白的提取

紅細(xì)胞分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少，未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時(shí)間過長，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。

5.2 檢測(cè)凝膠色譜柱的裝填是否成功的方法

由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。

5.3 凝膠的裝填標(biāo)準(zhǔn)：緊密、均勻

如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無數(shù)的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過，擾亂洗脫液的流動(dòng)次序，影響分離的效果。

5.4 沸水浴處理加入洗脫液的濕凝膠的目的

這樣操作不但節(jié)約時(shí)間，還能除去凝膠中可能帶有的微生物，排除凝膠內(nèi)的空氣。

5.5 G--75

“G”代表凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度及分離范圍，75表示凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5g。

5.6 裝填完后，立即用洗脫液洗脫的目的

此操作的目的是使凝膠裝填緊密。

5.7 實(shí)驗(yàn)過程加入檸檬酸鈉

加入檸檬酸鈉的目的是防止血液凝固；低速、短時(shí)離心防止白細(xì)胞沉淀；緩慢攪拌防止紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。

5.8 檢測(cè)血紅蛋白的分離是否成功的方法

如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。

6 典型例題

【例1】在血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)中，下列操作正確的是( )

A 分離紅細(xì)胞時(shí)需去除上層透明的黃色血漿

B 紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白時(shí)只需加入蒸餾水

C 分離血紅蛋白溶液是低速短時(shí)間離心

D 洗脫時(shí)，待紅色蛋白質(zhì)下移即開始收集流出液

思維啟導(dǎo)：紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白除需加入蒸餾水，還需加入40％體積的甲苯；分離血紅蛋白溶液是高速長時(shí)間離心；洗脫時(shí)，待紅色蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5 mL收集一管，連續(xù)收集。

參考答案：A。

【例2】下列有關(guān)提取和分離血紅蛋白的程序，敘述錯(cuò)誤的是( )

A 樣品的處理就是通過一系列操作收集到血紅蛋白溶液

B 通過透析可能去除樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)，此為樣品的粗提取

C 可通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化

D 可通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白的純度

思維啟導(dǎo)：首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經(jīng)過透析去除相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化；最后經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定，由此可知B的敘述錯(cuò)誤。由玻璃紙制成的透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi)，透析可以去除樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)。

參考答案：B。

【例3】紅細(xì)胞含有大量的血紅蛋白，紅細(xì)胞的機(jī)能主要是由血紅蛋白完成，血紅蛋白的主要功能是攜帶氧氣或二氧化碳，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動(dòng)物的血液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，來提取和分離血紅蛋白，請(qǐng)回答下列有關(guān)問題：

(1)實(shí)驗(yàn)前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預(yù)先加入檸檬酸鈉，取血回來，馬上進(jìn)行離心，收集血紅蛋白溶液。

①加入檸檬酸鈉的目的是___________。

②以上所述的過程即是樣品處理，它包括__________、_________、收集血紅蛋白溶液。

(2)收集的血紅蛋白溶液在透析袋中可以經(jīng)過透析，這就是樣品的粗分離。

①透析的目的是

②透析的原理是

(3)然后通過凝膠色譜法將樣品進(jìn)一步純化，最后經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。

①樣品純化的目的是__________。

②血紅蛋白有什么特點(diǎn)?

這一特點(diǎn)對(duì)進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義?

思維啟導(dǎo)：檸檬酸鈉是一種抗凝劑，能夠防止血液凝固。凝膠色譜柱中如果產(chǎn)生了氣泡，氣泡就會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。

參考答案：

(1)①防止血液凝固

②紅細(xì)胞的洗滌血紅蛋白的釋放

(2)①去除分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)

②透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而大分子則保留在袋內(nèi)

(3)①通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去

②血紅蛋白呈現(xiàn)紅色，在凝膠色譜分離時(shí)，可以通過觀察顏色來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液

使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作