(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京 210028)

我國是乙型肝炎病毒(hepatitis B Virus，HBV)感染的高發(fā)區(qū)，HBV感染的診斷主要依賴于患者血清中病毒標(biāo)志物和病毒核酸(HBV DNA)的檢出。乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)是HBV表面的外膜蛋白，由病毒S基因編碼，在病毒感染肝細(xì)胞過程中起重要作用。最近一些研究證明HB-sAg 和 HBV DNA 水平之間有良好的相關(guān)性［1－2］，定量檢測血清中HBsAg可以反映宿主體內(nèi)HBV DNA的水平，對評價(jià)抗病毒藥物治療的療效和判斷預(yù)后有重要意義［3］，同時(shí)對于一些HBV DNA呈陰性的慢性乙肝患者，血清中HBsAg的含量就為臨床醫(yī)生的診斷及治療提供了良好的依據(jù)。目前，我院采用ARCHITECT i2000SR化學(xué)發(fā)光分析儀對血清中的HBsAg進(jìn)行定量檢測。臨床上有些乙肝患者HBsAg定量測定結(jié)果超出該儀器所能檢測的線性范圍，為了得到準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，幫助臨床醫(yī)生更好地了解疾病進(jìn)展，常需要對高濃度HBsAg血清進(jìn)行稀釋后再測定。

1 材料和方法

1．1 血清標(biāo)本

篩選收集乙肝患者血清 HBsAg定量＞250 IU·ml－1的標(biāo)本血清，標(biāo)本來源于南京市鼓樓醫(yī)院門診。標(biāo)本要求無明顯溶血、脂血。

1．2 混合低值血清制備

收集本院住院病人中乙肝兩對半定量結(jié)果全陰性的血清標(biāo)本，混勻后2 000 r·min－1離心取其上清液(經(jīng)檢測 HBsAg 為 0．02 IU·ml－1)。

1．3 儀器與試劑

美國雅培公司生產(chǎn)的ARCHITECT i2000SR全自動化學(xué)發(fā)光儀及配套試劑(含HBsAg專用稀釋液)、生理鹽水、蒸餾水、自制混合低值血清等。

1．4 實(shí)驗(yàn)方法

將不同患者的高濃度 HBsAg血清(＞250 IU·ml－1)分別用專用稀釋液、生理鹽水、混合低值血清及蒸餾水按照1∶100的比例(5 μl血清加入495 μl稀釋液)稀釋，充分混勻后取雙份上機(jī)檢測HBsAg含量。操作步驟嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，測定在1 h內(nèi)完成。

1．5 統(tǒng)計(jì)方法

用Microsoft Excel系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間比較用配對t檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

高值HBsAg血清標(biāo)本分別用HBsAg專用稀釋液、生理鹽水、混合低值血清及蒸餾水按照1∶100比例稀釋后經(jīng)ARCHITECT i2000SR化學(xué)發(fā)光儀測HBsAg濃度值，結(jié)果見表1。

表1 高濃度HBsAg用不同稀釋液稀釋后的測定結(jié)果及偏差Tab 1 The results of concentration of HBsAg diluted with different diluents

生理鹽水和蒸餾水作為稀釋液后的測定值與專用稀釋液稀釋后的測定值相比，P＜0．05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，所以在日常檢測中，不能用生理鹽水或蒸餾水作為化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定HBsAg的稀釋液;而混合低值血清稀釋后的測定值與專用稀釋液相比偏差較小，P＞0．05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故混合低值血清可以作為替代稀釋液用于化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定HBsAg。

3 討 論

雅培ARCHITECT i2000SR全自動免疫分析儀核心技術(shù)為化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析(chemiluminesent micropaticle immunoassay)，以吖叮酯作為標(biāo)記發(fā)光劑，主要用于測定蛋白質(zhì)、病毒抗原等大分子物質(zhì)，試劑具有極高的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性。它對HBsAg的可測范圍是0～250 IU·ml－1，而臨床上有些血清的HB-sAg往往超出了該檢測范圍，所以需要稀釋后再測定，但是由廠家提供的專用稀釋液價(jià)格相當(dāng)昂貴且保存有效期很短，有時(shí)會有供貨不及時(shí)或稀釋液超過有效期的情況發(fā)生。本研究通過用生理鹽水、混合低值血清、蒸餾水作為稀釋液來稀釋高濃度的HBsAg血清，旨在探討三者對血清HBsAg測定的影響，以期選擇出合適的稀釋液來代替專用稀釋液。免疫反應(yīng)體系中的蛋白分子種類及含量、pH值、離子強(qiáng)度對免疫反應(yīng)本身有較大影響。待測血清經(jīng)稀釋后如果反應(yīng)體系發(fā)生明顯變化，則會影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性［4］。

通過這3種稀釋液分別對11份不同乙肝患者血清稀釋后進(jìn)行測定，比較偏差計(jì)算結(jié)果發(fā)現(xiàn)用生理鹽水及蒸餾水稀釋后測得的結(jié)果都偏高，均存在明顯偏差，分別為 －2．05% ～157．81%、－16．32% ～313．64%，而用混合低值血清稀釋后的偏差為－35．03% ～32．60%，與專用稀釋液稀釋后測定值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？赡芤?yàn)榈椭祷旌涎宓牡鞍踪|(zhì)、pH值、離子強(qiáng)度和其他血清成分與樣本血清基本相近，因此其測定結(jié)果偏差最小。因只對較高濃度HBsAg的血清標(biāo)本(一般＞250 IU·ml－1)進(jìn)行稀釋，所以用混合低值血清稀釋測定的偏差并不影響對HBsAg定量結(jié)果的陰陽性判定，僅對其高濃度的值有所影響，而這個(gè)結(jié)果應(yīng)該是可以接受的。生理鹽水的離子強(qiáng)度、pH值與血清相近，但缺乏蛋白質(zhì)和血清成分，所以測定結(jié)果偏差較大。而蒸餾水與血清相比在蛋白質(zhì)、pH值方面均相差較大，不適宜作為免疫反應(yīng)的血清稀釋液，這與丁忠旗等［5－7］研究結(jié)果一致?？紤]到胎牛血清在離子強(qiáng)度、pH值方面與人血清接近，另選取5份高濃度HBsAg的血清標(biāo)本稀釋后進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)與專用稀釋液比較偏差亦較大，可超過100%(結(jié)果未在表1中列出)，可能是胎牛血清中所含蛋白種類和人血清相比有一定差異，對整個(gè)反應(yīng)體系有影響所致。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雅培ARCHITECT i2000SR全自動免疫分析儀在測定HBsAg濃度時(shí)，如遇到超出儀器線性范圍(＞250 IU·ml－1)的標(biāo)本需進(jìn)行稀釋，除專用稀釋液外，低值血清可以作為替代稀釋液使用，以測定高濃度HBsAg的實(shí)際值來觀察患者病情及轉(zhuǎn)歸。

［1］孫長義，王山梅．乙肝病毒標(biāo)志物與PCR-HBV定量水平的關(guān)系［J］．中國公共衛(wèi)生，2002，18(12):1480-1481．

［2］侯遠(yuǎn)沛，宋麗．乙型肝炎標(biāo)志物定量檢測結(jié)果與HBV-DNA含量相關(guān)性分析［J］．實(shí)用醫(yī)技雜志，2004，11(10):2112-2113．

［3］陳祥勝，廖雯君．乙肝HBsAg定量檢測的臨床診斷意義［J］．湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，11(2):21-23．

［4］高云朝，楊亞東，陸漢魁．稀釋介質(zhì)對化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測血清HCG的影響［J］．標(biāo)記免疫分析與臨床，2007，14(2):121，72．

［5］丁忠旗，李永培，盛強(qiáng)．不同稀釋液對高濃度HCG測定值的影響［J］．中華核醫(yī)學(xué)雜志，2002，22(1):39．

［6］朱誠憶，胡建軍．不同稀釋液對RIA測定高濃度AFP的影響［J］．上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2000，15(3):140．

［7］陳春華．探討用不同稀釋液對RIA測定高濃度AFP的影響［J］．華西醫(yī)學(xué)，2003，18(2):247．