吳大鵬,盧 紅,張洪志

河南大學淮河醫(yī)院腫瘤科開封 475000

△男,1976年1月生,碩士,主治醫(yī)師,研究方向:腫瘤放射治療,E-mail:wudapeng321@163.com

舌鱗狀細胞癌在口腔癌中最常見[1],目前采用傳統(tǒng)手術治療并輔以放療和化療等綜合治療手段,舌癌治愈率仍只有10%～45%。因此,深入認識腫瘤放射敏感性調(diào)控機制,通過人工干預增強放射敏感性,對提高腫瘤放療效果具有重要的意義。為了解 β-欖香烯乳聯(lián)合照射是否能提高人舌鱗狀細胞癌裸鼠移植瘤的治療效果及其對腫瘤細胞凋亡和裸鼠外周血白細胞的影響,作者進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 人舌鱗狀細胞癌細胞株(Tca-8113細胞,上海交通大學口腔醫(yī)學院惠贈);BALB/c雄性裸鼠,7周齡,體質(zhì)量18～22 g(購自中山大學實驗動物中心);β-欖香烯乳規(guī)格為0.1 g/20 mL (購自大連華立金港制藥集團有限責任公司);RPMI 1640(購自Gibco公司);DNA-Prep(流式細胞儀試劑,購自Beck Man Coulter公司);主要實驗儀器有雙光子直線加速器、流式細胞儀和血常規(guī)檢測儀等。

1.2 Tca-8113細胞的培養(yǎng)和裸鼠移植瘤模型的建立 常規(guī)培養(yǎng)并收集Tca-8113細胞,用RPMI 1640培養(yǎng)液制成密度為 1×107m L-1的腫瘤細胞懸液備用。在無菌條件下從每只裸鼠右側(cè)大腿處向皮下注射2×106個腫瘤細胞(0.2 mL/只),建立Tca-8113細胞裸鼠皮下移植瘤模型。

1.3 實驗分組與處理 腫瘤移植后第 8天,從 60只移植瘤裸鼠中選擇40只瘤體大小約0.1 cm3的裸鼠,隨機分成5組,每組8只。空白組:0.2 mL生理鹽水腹腔內(nèi)注射,每天1次,連續(xù)注射5 d;單純藥物組:β-欖香烯乳按50mg/kg用生理鹽水稀釋至0.2 mL腹腔內(nèi)注射,每天1次,連續(xù)注射5 d;單純照射組:裸鼠固定于特制的鉛盒中屏蔽射線以保護正常組織,將患肢固定并暴露于照射野中,電子線照射移植瘤,每次2 Gy,每天1次,連續(xù)照射5 d;藥物(1 h)﹢照射組:用β-欖香烯乳作用1 h后照射,余操作過程同單純藥物組和單純照射組;藥物(2 h)﹢照射組:用β-欖香烯乳作用2 h后照射,余操作過程同單純藥物組和單純照射組。

1.4 裸鼠腫瘤生長時間的測定 細胞接種后連續(xù)觀察移植瘤形成和生長情況,用游標卡尺測量腫瘤最長徑a和最短徑b(mm),每3 d測1次,根據(jù)公式:移植瘤體積 =ab2/2進行計算。各組裸鼠移植瘤體積達到約0.1 cm3后進行實驗處理,連續(xù)測量并觀察移植瘤體積變化,當體積達到 1.2 cm3后終止裸鼠飼養(yǎng)。腫瘤生長時間為各組移植瘤體積從0.1 cm3生長至1.2 cm3的時間。

1.5 裸鼠外周血白細胞數(shù)檢測 當各組裸鼠移植瘤體積達到1.2 cm3后,從眼球后靜脈叢抽取血液使用血常規(guī)檢測儀檢測白細胞總數(shù)。

1.6 移植瘤細胞凋亡率的測定 采用流式細胞儀法。各組裸鼠抽血后,分別采用脫頸法處死并剝離腫瘤,切成0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm大小組織塊,置于體積分數(shù)為 70%冷乙醇中固定,4℃過夜。用勻漿法及等梯度稀釋法制成細胞密度為 105mL-1細胞懸液,收集細胞于離心管內(nèi),1 000 r/min離心5 min后,棄上清液。PBS洗滌、離心后用體積分數(shù)為70%冷乙醇固定,4℃過夜。上機測試前,再用PBS洗3次。加入碘化丙啶(PI)染液,4℃染色30 min。取樣本 200μL,上流式細胞儀進行細胞凋亡分析。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 10.0對各組裸鼠腫瘤生長時間、外周血白細胞數(shù)及細胞凋亡率進行析因設計的方差分析,檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠移植瘤的成瘤和生長情況 60只裸鼠接種腫瘤成瘤率為85%(51/60)。各組裸鼠腫瘤生長時間見表 1、表 2。

表1 各對照組和藥物(1 h)+照射組裸鼠腫瘤生長時間比較(n=8) d

表2 各對照組和藥物(2 h)+照射組裸鼠腫瘤生長時間比較(n=8) d

2.2 裸鼠外周血白細胞數(shù)檢測結(jié)果 見表3、表4。

2.3 裸鼠移植瘤細胞凋亡率檢測結(jié)果 見表5、表6。

表3 各對照組和藥物(1 h)+照射組裸鼠外周血白細胞數(shù)比較(n=8)×109 L-1

表4 各對照組和藥物(2 h)+照射組裸鼠外周血白細胞數(shù)比較(n=8)×109 L-1

表5 各對照組和藥物(1 h)+照射組裸鼠移植瘤細胞凋亡率比較(n=8) %

表6 各對照組和藥物(2 h)+照射組裸鼠移植瘤細胞凋亡率比較(n=8) %

3 討論

β-欖香烯乳是從中藥莪術中提取出來的具有抗癌活性的國家二類抗癌新藥,已廣泛應用于臨床,其抗癌機制與抑制DNA和RNA合成及誘導腫瘤細胞凋亡有關,在低細胞毒性濃度下即可對離體培養(yǎng)的Tca-8113細胞有放射增敏作用[2]。該研究中在照射與藥物 2個因素組合下經(jīng)析因設計的方差分析后發(fā)現(xiàn):照射與藥物(1和2 h)分別對腫瘤生長時間有影響,可以延長裸鼠腫瘤生長時間;藥物(1 h)+照射組照射間無交互作用,尚不能認為是否給予藥物對有無照射的裸鼠生長時間有影響,而藥物(2 h)+照射組照射間有交互作用,說明藥物與受照射之間有交互協(xié)同作用,聯(lián)合作用較單獨照射或單獨藥物作用更能延長裸鼠腫瘤生長時間。提示對 β-欖香烯乳作用 1 h后再放療不能達到提高放射敏感性的目的,而作用2 h聯(lián)合放療的療效要大于單純藥物或單純放射治療的療效,且 2者聯(lián)合起到協(xié)同增敏效果。

研究[3-4]顯示凋亡反應的提高提示細胞有更大的放射敏感性?，F(xiàn)在學術界已提出將誘導凋亡水平作為腫瘤放射敏感性的一種衡量指標[5-6]。該研究中流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率:藥物(1 h)+照射組照射間無交互作用,尚不能認為是否給予藥物對有無照射的裸鼠腫瘤細胞凋亡率有影響;而藥物(2 h)+照射組,藥物組主效應差異有統(tǒng)計學意義,照射組主效應差異有統(tǒng)計學意義,說明藥物作用2 h與照射分別對腫瘤細胞凋亡率有影響,不同程度提高腫瘤細胞凋亡率。藥物作用 2 h和照射間有交互作用,即聯(lián)合作用較單純藥物或單純照射更能有效提高腫瘤細胞凋亡率,這一用聯(lián)合作用方法提高腫瘤凋亡率的趨勢與聯(lián)合作用延長腫瘤生長時間的趨勢相一致。提示:β-欖香烯乳作用 2 h后聯(lián)合照射所致腫瘤細胞凋亡率的提高可能是聯(lián)合協(xié)同增敏的原因之一,聯(lián)合措施處理腫瘤后可能重建了某種腫瘤抑制基因介導的細胞凋亡途徑,從而達到提高放射治療療效和放射增敏的目的。

因為 β-欖香烯不含蒽環(huán)、苯環(huán)、環(huán)氧及硝基等毒性基團,所以無骨髓抑制作用,對肝腎功能無損害,是一種有效且較安全的抗腫瘤藥物。該研究結(jié)果顯示藥物(1 h)+照射組和藥物(2 h)+照射組:藥物組主效應差異無統(tǒng)計學意義,用藥 +照射無交互作用,尚不能說明是否給予藥物對有無照射的裸鼠白細胞數(shù)有影響。該研究證實:單純 β-欖香烯乳作用于裸鼠后外周血白細胞數(shù)變化不大,未出現(xiàn)骨髓抑制,是一種有效且較安全的抗腫瘤藥物;藥物聯(lián)合照射組外周血白細胞總數(shù)降低系照射所致,與 β-欖香烯乳作用無關。

總之,該研究結(jié)果證實:β-欖香烯乳聯(lián)合照射能提高人舌鱗狀細胞癌裸鼠移植瘤的放射治療效果,照射前2 h應用β-欖香烯乳能起到放射增敏的作用;聯(lián)合作用能有效誘導細胞凋亡,且 β-欖香烯乳對白細胞沒有明顯抑制作用。

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