穆 松,鐘金城,陳智華,徐利娟

(西南民族大學(xué)動(dòng)物遺傳育種學(xué)國家民委—教育部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610041)

自20世紀(jì)90年代以來,作為小分子RNA家族中的一員,MicroRNA(miRNA)已受到廣泛的關(guān)注,2006年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)就頒發(fā)給了小分子 RNA的研究者。許多研究表明,無論是線蟲還是哺乳動(dòng)物,其體內(nèi)的miRNA通過分裂或轉(zhuǎn)錄抑制目標(biāo)mRNA達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)以及生長發(fā)育、細(xì)胞增殖和凋亡等作用[1]。

miRNA是長度為20～24個(gè)堿基(nt)的非編碼單鏈RNA,廣泛存在于真核生物中,其本身不具備開放閱讀框(ORF:Open Read Frame)。成熟的miRNA 5'端為一磷酸基團(tuán),3'端為羥基,可同上游或下游的序列部分地配對形成莖環(huán)結(jié)構(gòu),miRNA是由具有莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)的miRNA前體(per-miRNA)加工而成。許多試驗(yàn)表明,miRNA前體在物種間具有高度的進(jìn)化保守性,其中以莖環(huán)部保守性最強(qiáng)。miRNA的表達(dá)還具有特異性和時(shí)序性特點(diǎn),在生物體的不同組織中有不同類型的miRNA,生長發(fā)育的不同階段也存在不同種類的miRNA。這些性質(zhì)都表明miRNA參與了復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控過程,并決定了生物的生長發(fā)育及其行為等變化[2]。

生物信息學(xué)技術(shù)是預(yù)測和發(fā)現(xiàn)新miRNA的有效辦法[3-5]。大部分的miRNA序列在動(dòng)物中高度保守,通過計(jì)算機(jī)軟件和其他計(jì)算工具可以預(yù)測、鑒定出生物的miRNA,并可以利用EST、GSS數(shù)據(jù)庫對miRNA進(jìn)行大規(guī)模的生物信息學(xué)預(yù)測和分析[6-8]。本研究根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的牛EST、GSS信息以及豬、家犬、人、大猩猩和小家鼠5種哺乳動(dòng)物的已經(jīng)注冊miRNA分子信息,預(yù)測?；蚪M中新的候選miRNA,以期為進(jìn)一步尋找牛的miRNA和遺傳育種研究提供一條新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 miRNAs、ESTs和 GSSs序列的獲得 牛、豬、家犬、小家鼠、大猩猩、人等6種動(dòng)物的miRNA序列來自于miRBase數(shù)據(jù)庫(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences;Release 13.0,March 2009)[9]。牛的EST、GSS[15]和mRNA序列來自于美國國家生物技術(shù)信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的GeneBank核酸數(shù)據(jù)庫。

1.2 分析軟件 序列比對軟件為blast-2.2.0-ia32-win32(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/release/2.2.20/blast-2.2.20-ia32-win32.exe),二級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用RNA structure軟件進(jìn)行,蛋白質(zhì)序列比對在NCBI提供的Web服務(wù)BlastX(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中進(jìn)行[17]。

1.3 ?；蚪M中新的miRNAs預(yù)測 綜合文獻(xiàn)[10-11,18]以及通過對牛已經(jīng)注冊的miRNA序列進(jìn)行分析得到本研究的篩選標(biāo)準(zhǔn)為:①新預(yù)測的miRNA與成熟的miRNA只能存在0～3個(gè)堿基差異;②新預(yù)測miRNA的前體能折疊成發(fā)夾二級結(jié)構(gòu);③發(fā)夾結(jié)構(gòu)必須有較小的自由能[14];④miRNA中的A+U含量在30%～70%之間;⑤miRNA與其互補(bǔ)序列的差異不能多于6個(gè);⑥在miRNA中不能存在環(huán)狀結(jié)構(gòu)。符合以上標(biāo)準(zhǔn)的序列即為本研究所預(yù)測到的?；蚪M中新的miRNA序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 ?；蚪M中新miRNA的預(yù)測 根據(jù)miRNA高度保守的特點(diǎn),本研究按照圖1所示的思路尋找?；蚪M中新的 miRNA。首先下載人、大猩猩、豬、家犬、小家鼠等5個(gè)物種的共1 737條miRNA序列,并與牛的已知miRNA進(jìn)行比對刪除相同序列,5個(gè)物種間也進(jìn)行比對刪除相同序列,得到了1 445條無重復(fù)的目標(biāo)序列;然后用篩選出的1 445條序列與牛GSS、EST數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行Blast比對,選取其中存在0～3個(gè)堿基的同源序列,并刪除重復(fù)和表達(dá)蛋白的序列,最終得到229條序列,其中來自于GSS序列148條、EST序列 81條。

將上述229條序列下載后,選擇包含有miRNA相似序列的前后總長共100 nt的片段利用RNAstructure軟件進(jìn)行折疊,觀察其二級結(jié)構(gòu)和自由能大小,得到能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)且具有較小自由能的共34條序列,其中來自于EST、GSS的序列分別為12條和22條。但是符合A+U堿基含量在30%～70%條件的只有21條序列,來自 EST、GSS的序列數(shù)量分別為8條和13條。

將得到的21條miRNA候選序列與sanger數(shù)據(jù)庫per-miRNA分子(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/search.shtml)進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)同源性較高的有17條,即此17條序列就是本研究預(yù)測得到的?；蚪M中新的miRNA序列(表1)。

圖1 牛基因組中新的miRNA篩選思路

2.2 ?；蚪M中新miRNA前體的結(jié)構(gòu)特征 由于miRNA序列很短,在基因組中找到匹配序列的概率較大,僅僅搜索相似序列將會(huì)產(chǎn)生大量的假陽性結(jié)果,如果結(jié)合這些相似序列的側(cè)翼序列可能形成二級結(jié)構(gòu)來進(jìn)一步篩選,能大大減少假陽性率[12]。由圖2展示的二級結(jié)構(gòu)可見,本研究得到的17條候選per-miRNAs可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),包含真正的miRNAs的可能性極大,也表明本研究結(jié)果的可靠性。

表1 ?；蚪M中新的miRNA序列

發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)的形成是miRNA成熟過程中的一個(gè)重要步驟,也是miRNA的一個(gè)重要特征,但是發(fā)夾結(jié)構(gòu)并不是miRNA分子所特有的[13],有些RNAs也能形成類似的發(fā)夾結(jié)構(gòu)(mRNA、tRNA、rRNA)。為了避免將其它的RNAs誤認(rèn)為miRNA,本研究引入了自由能(free energy),對已有的per-miRNA統(tǒng)計(jì)分析表明,per-RNA具有較小的自由能(表1),說明預(yù)測得到的miRNAs符合具有較小自由能的條件。

圖2 ?；蚪M中候選miRNA前體分子的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

3 討論

在真核生物中,miRNA具有序列十分保守、前體能折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)、具有較小自由能等特點(diǎn)。本研究得到的17條miRNA,符合miRNA的所有特征,大小在20～24 nt,均能形成發(fā)夾狀的二級結(jié)構(gòu),且自由能較小,這表明本研究篩選得到的17條序列可能是?；蚪M中新的miRNA,這對牛的遺傳育種研究和畜牧業(yè)生產(chǎn)具有一定的價(jià)值和意義,當(dāng)然這一結(jié)果還需要經(jīng)過生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的最終驗(yàn)證。

本研究利用生物信息學(xué)方法,預(yù)測到了17條?；蚪M的miRNA候選基因序列,它們都與已知的miRNAs序列高度相似。在生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)用芯片技術(shù)通過雜交能夠發(fā)現(xiàn)大量的miRNA分子,但是無法直接得到miRNA前體序列、基因位置和靶基因等信息[16]。但是通過生物信息學(xué)方法,除了在對比過程中就能了解前體信息外,還能了解到其靶基因信息,具有許多優(yōu)越性。這說明根據(jù)miRNA的保守性和物種之間基因組的同源性,用生物信息學(xué)理論和方法篩選、尋找新的miRNA候選序列的方法能夠在較短時(shí)間里尋找出一定量的新miRNA分子,速度快、通量大,是一條行之有效的在生物體內(nèi)尋找到更多miRNA分子的新思路和途徑。

經(jīng)過多年的發(fā)展,同源序列搜索的方法已經(jīng)取得了很大成功,但是本質(zhì)上需要已知的miRNAs/permiRNAs為參照,搜索與已知miRNAs/per-miRNAs在序列上和結(jié)構(gòu)上同源的 miRNAs/per-miRNAs,對于不與已知miRNAs/per-miRNAs同源的miRNAs/per-miRNAs則無能為力。這也說明生物信息學(xué)分析得到的結(jié)果是否正確還需要進(jìn)一步的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,在生物學(xué)研究中把生物信息學(xué)研究與生物學(xué)實(shí)驗(yàn)有機(jī)地結(jié)合是十分重要和必要的。

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