卞欣欣,董志遠,郭 璇,賈新建,邵 偉,景 煒,蒲雪松,余 雄

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院,烏魯木齊 830052;2.新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所)

隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展,大量藥物在生產(chǎn)中被廣泛的使用。食品動物在使用獸藥后,獸藥的原形及其代謝物等有可能蓄積或殘存在動物的細胞、組織或器官內,或進入泌乳動物的乳、或產(chǎn)蛋家禽的蛋中,藥物殘留危害著人類的健康。隨著人們生活水平的提高,近年來畜產(chǎn)品中藥物殘留問題日益受到重視。但是到目前為止,國內外關于抗生素和驅蟲藥在綿羊和肉雞各組織中殘留量的研究較少,難以滿足畜牧生產(chǎn)的需要。新疆地區(qū)羊肉和雞肉生產(chǎn)過程中獸藥的使用和殘留情況的研究較少,因此本試驗在這方面進行了研究,為畜禽生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 哈薩克羊15只,年齡9～10月齡,體重40～45 kg,沒有使用過任何抗生素和驅蟲類藥物。新疆泰昆集團阜康500商品雞場提供的42日齡AA肉雞10只。

1.2 儀器與試劑 Agilent1100系列高效液相色譜儀及化學工作站,包括自動進樣器、熒光檢測器、DAD檢測器、紫外檢測器、視差檢測器、恒溫柱溫箱、真空在線脫氣裝置,550型酶標儀(配備450 nm濾光片),氮吹儀(N-EVAPTM-111,美國Organomation Associates公司),離心機(TDL-40B,上海安亭科學儀器廠),Millipore超純水制備器,旋渦混合儀,振蕩混合儀,恒溫水浴箱,超聲波清洗機,分析天平(感量0.000 01 g),天平(感量0.01 g)。乙腈、甲醇、正己烷、丙酮、乙醚、乙酸乙酯為色譜純;二乙胺為分析純。標準品:阿苯達唑、阿苯達唑砜、阿苯達唑亞砜、鹽酸左旋咪唑、吡喹酮由美國Sigma公司提供,含量均大于99%。試劑盒由北京望爾生物技術有限公司生產(chǎn)。

1.3 藥物與設計

1.3.1 綿羊的投藥方法及樣品采集 試驗在新疆農(nóng)業(yè)大學動物試驗場進行,為期40 d。由于各種藥物的休藥期不同,因此將15只羊隨機分為3組,每組5只,且組間體重差異不顯著(P＞0.05)。試驗綿羊的用藥程序如表1所示,投藥后5、15、25 d各隨機選擇1組宰殺,取其肌肉(包括臀肌、半腱肌、背最長肌)、肝臟和腎臟組織,-20℃冰箱中保存待測。對所采集的樣品測定每種藥物的殘留量,并研究其在綿羊組織中的殘留規(guī)律。

表1 綿羊的投藥程序

1.3.2 肉雞樣品的采集 實驗中AA肉雞的投藥程序依照新疆地區(qū)商品肉雞的標準進行,在第42天(出欄)隨機抽取10只,宰殺,取其胸肌、腿肌、心臟、肝臟和腎臟組織,-20℃冰箱中保存待測。強力霉素在雞10～13、16～19日齡時投放,劑量4 mg/kg;硫酸新霉素在雞16～19、31～33日齡時投放,劑量16 mg/kg。由于以上2種藥物在肉雞的飼養(yǎng)過程中使用的頻率特別高,因此,在出欄時主要針對這2種藥物的殘留做了檢測。

1.4 樣品處理 吡喹酮的樣品處理按照農(nóng)業(yè)部958號公告-11-2007的步驟操作;阿苯達唑的樣品處理按照農(nóng)業(yè)部958號公告-9-2007的步驟操作;左旋咪唑的樣品處理按照JAP-175左旋咪唑檢測方法處理;綿羊組織中青霉素鈉、硫酸鏈霉素、頭孢噻呋鈉、伊維菌素和肉雞組織中強力霉素、新霉素的樣品處理與結果計算按試劑盒說明的操作程序進行。

1.5 色譜分析條件 吡喹酮色譜柱:XTerra C18柱(250 mm ×4.6 mm,4.5μ m),以乙腈、水為流動相,梯度洗脫程序見表2,流速0.9 mL/min,柱溫28℃,進樣量10 μ L,紫外檢測器檢測,檢測波長214 nm。

表2 流動相梯度洗脫程序

左旋咪唑色譜柱:XTerra C18柱(250 mm×4.6 mm,4.5 μ m),以乙腈∶磷酸二氫鉀—二乙胺緩沖液(pH7.5)(3∶7)的混合溶液為流動相,流速 1.0 mL/min,柱溫 35℃,進樣量 20 μ L,DAD 檢測器檢測,檢測波長 250 nm。

阿苯達唑色譜柱:XTerra C18柱(250 mm×4.6 mm,4.5 μ m);流動相 :A 相:乙腈,B 相:水 ,C 相 :10%冰乙酸;梯度洗脫程序見表3,流速1.0 mL/min,柱溫25℃,進樣量 20 μ L,DAD檢測器檢測,檢測波長292 nm。

表3 流動相梯度洗脫程序

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法 實驗中數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示,運用SPSS 13.0進行方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 綿羊組織中藥物殘留情況

2.1.1 抗生素類藥物殘留檢測結果 表4表明,青霉素鈉在腎臟組織中的殘留量極顯著(P＜0.01)地高于肝臟和肌肉組織;肝臟與肌肉中青霉素鈉的殘留量未表現(xiàn)出顯著差異(P＞0.05);結果顯示,腎臟＞肝臟＞背最長?。就渭。景腚旒　ｎ^孢噻呋鈉在綿羊各組織的殘留量均未表現(xiàn)出顯著差異(P＞0.05),并且殘留量較低,在3μ g/kg左右。

表4 停藥5 d青霉素鈉、頭孢噻呋鈉在綿羊組織的殘留量(n=5) μ g/kg

表5表明,停藥10 d時硫酸鏈霉素在肝臟和腎臟中的殘留量與肌肉組織相比差異極顯著(P＜0.01),腎臟中殘留量最高,達242 μ g/kg,各肌肉組織間差異不顯著(P＞0.05);停藥20 d時硫酸鏈霉素在肝臟和腎臟中的殘留量與肌肉組織相比差異極顯著(P＜0.01),肝臟和腎臟中硫酸鏈霉素的殘留量是肌肉組織的6.5倍,臀肌、半腱肌和背最長肌中硫酸鏈霉素的殘留量差異不顯著(P＞0.05);停藥30 d時,硫酸鏈霉素在肝臟和腎臟中的殘留量與肌肉組織相比差異極顯著(P＜0.01),肝臟中殘留量最高,達到 219μ g/kg,各肌肉組織間差異不顯著(P＞0.05)。

在停藥10 d時,臀肌、半腱肌和背最長肌中硫酸鏈霉素殘留量與20 d相比差異極顯著(P＜0.01),停藥10 d時硫酸鏈霉素在各肌肉組織內的殘留量是停藥20 d時的4倍左右,不過這三個部位在20 d和30 d未表現(xiàn)出顯著差異(P＞0.05);第10 d、20 d和30 d肝臟中硫酸鏈霉素殘留量差異不顯著(P＞0.05);比較硫酸鏈霉素在腎臟中的殘留量,在10 d和20 d差異不顯著(P＞0.05),30 d殘留量比前兩批下降了20%,與前兩批比較差異極顯著(P＜0.01)。

表5 硫酸鏈霉素在綿羊組織的檢測結果(n=5) μ g/kg

2.1.2 抗寄生蟲類藥物殘留檢測結果 停藥17 d時,伊維菌素在綿羊不同組織的平均殘留量分別是:臀肌 2μ g/kg 、半腱肌 1μ g/kg、腎臟 3.2μ g/kg,肝臟和背最長肌未檢出;停藥27 d時的樣品未檢出。左旋咪唑、阿苯達唑和吡喹酮均未檢出。

2.2 肉雞組織中獸藥殘留情況 表6表明,肉雞(42 d)出欄時,新霉素在胸肌、腿肌和心臟中的殘留量與肝臟、腎臟比,差異極顯著(P＜0.01),胸肌和腿肌中新霉素的殘留量最高,肝臟和腎臟最低,殘留量僅為肌肉中的四分之一;強力霉素在腎臟中的殘留量與其他組織相比差異極顯著(P＜0.01),腎臟中的殘留量比肌肉、心臟和肝臟高10倍左右。

表6 出欄肉雞不同組織中藥物的殘留量(n=10) μ g/kg

3 討論與結論

3.1 討論

3.1.1 停藥5 d時檢測綿羊各組織中青霉素鈉的殘留情況,腎臟內的殘留量最高,達到 40.70μ g/kg,是肝臟的4倍,肌肉中的殘留量最低,僅為腎臟殘留量的六分之一。研究結果表明,在肝臟和肌肉組織中的殘留量較低,說明青霉素鈉在這兩種組織中的代謝速率比較快。青霉素鈉在腎臟中含量較高,在腎功能正常的情況下,50%～75%自腎臟排出;小部分在肝臟內代謝[1]。本試驗腎臟中青霉素鈉的殘留量最高,這與前人研究結果相似。目前,國內尚無青霉素鈉在綿羊組織殘留量的報道,只有少數(shù)幾種青霉素在牛奶中殘留檢測的報道[2]。中國和歐共體(EEC)規(guī)定食用組織中青霉素的最高殘留限量(MRL)標準為50μ g/kg,本試驗在停藥5 d時,青霉素鈉在綿羊各組織中的殘留量低于標準殘留限量。

3.1.2 頭孢噻呋鈉在綿羊停藥5 d時檢測,各組織內殘留量均極低,約3μ g/kg,在體內分布量依次為腎臟＞背最長?。就渭。靖闻K＞半腱肌。頭孢噻呋鈉在動物體內的殘留量非常低,FDA(美國藥品食品管理局)已確定其宰前停藥期與牛奶廢棄期為0 d[3]。由中國和歐共體(EEC)規(guī)定的食用組織中頭孢噻呋的最高殘留限量(MRL)標準可知,停藥5 d時,頭孢噻呋鈉在綿羊各組織的殘留量未超過標準殘留限量。

3.1.3 中華人民共和國獸藥典規(guī)定硫酸鏈霉素在綿羊上使用的休藥期是18 d,因此,分別在停藥10、20、30 d各檢測一批樣品,結果顯示,在10 d硫酸鏈霉素在各組織中殘留量最高,肝臟和腎臟的殘留量比肌肉組織的高一倍;停藥20 d,與10 d比較,肌肉組織中硫酸鏈霉素的殘留量減少了80%左右,但是肝臟和腎臟中殘留量變化不明顯;停藥30 d硫酸鏈霉素在綿羊肌肉組織中的殘留量較20 d下降了30%左右,肝臟和腎臟的殘留量下降了10%左右。說明硫酸鏈霉素在綿羊肌肉組織中的代謝速率在前20 d較快,20 d后由于殘留量較少,代謝速率降低。研究結果表明,硫酸鏈霉素在綿羊的肝臟和腎臟中代謝時間長,殘留量高;肌肉組織中代謝快,殘留量低。注射部位和腎臟中鏈霉素殘留滯留期較長,其他可食部分殘留量低[1]。歐盟對動物性食品中鏈霉素的最大殘留限量做了明確的規(guī)定[4],本試驗檢測的3批樣品均未達到標準殘留限量。

3.1.4 伊維菌素在停藥17 d檢測結果顯示,腎臟殘留量最高3.2 μ g/kg,腎臟＞臀?。景腚旒?肝臟和背最長肌未檢出。停藥27 d的樣品未檢出。放射標記伊維菌素代謝研究表明,肝臟和脂肪是伊維菌素進行生物轉化的兩個主要場所,同時也是藥物分布濃度最高,消除速度最為緩慢的兩種組織[5]。另有研究表明,羊皮下注射或內服0.3 mg/kg伊維菌素后,在體內殘留較多的組織包括肝臟、脂肪、骨骼和膽汁[6]。本研究表明,在休藥期內,伊維菌素在綿羊各組織中的殘留量低于歐共體(EEC)規(guī)定的標準殘留限量。

3.1.5 阿苯達唑在停藥后7 d未檢出。羊殘留消除研究表明,用藥后數(shù)日內組織中的代謝物濃度變化很大,羊一次內服15 mg/kg阿苯達唑后,肝臟中殘留量最高,休藥1 d,肝臟中總殘留量為16 mg/kg,休藥4 d和 20 d,殘留量降至 700μ g/kg和 170μ g/kg,只是組織中的殘留量較低[1]。

3.1.6 左旋咪唑在停藥后6 d,未檢出。研究表明,左旋咪唑口服后迅速被機體吸收,排泄分解迅速[7]。左旋咪唑及其代謝產(chǎn)物可自尿、糞便及呼吸道排出,自尿中排出的原形藥物約為服入總量的16%。給羊肌肉注射左旋咪唑10 mg/kg,10 min后即可自尿中測出,2 h后尿中含量最高,4 h后已全部消失[8]。

3.1.7 吡喹酮在停藥后17、27和37 d各檢測1批,均未檢出。

3.1.8 中國和歐共體(EEC)規(guī)定食用組織中新霉素的最高殘留限量(MRL)標準為,肌肉和肝臟 500 μ g/kg、腎臟1 000 μ g/kg。本試驗中,新霉素在肉雞胸肌和腿肌中殘留量最高,達5.7 μ g/kg,肝臟和腎臟最低,殘留量僅為肌肉中的四分之一。依據(jù)標準可知,新霉素在肉雞各組織中的殘留量低于標準殘留限量。

3.1.9 強力霉素在腎臟中的殘留量最高,達81.97 μ g/kg,比肌肉、心臟和肝臟高10倍多。強力霉素內服吸收良好,生物利用度達90%以上;體內分布廣泛,以腎臟和肝臟中濃度最高,骨和牙質次之[9]。本試驗中強力霉素在各組織中的殘留量均低于中國和歐共體(EEC)規(guī)定的標準殘留限量。

3.2 結論

3.2.1 綿羊肌肉注射青霉素鈉停藥5 d后檢測結果顯示,青霉素鈉在綿羊腎臟中的殘留量最高,是肝臟的4倍,肌肉組織中的殘留量最低。

3.2.2 綿羊肌肉注射頭孢噻呋鈉停藥5 d時在各組織中的殘留量均極低。

3.2.3 綿羊肌肉注射硫酸鏈霉素,分別在停藥10、20和30 d后檢測。結果表明,硫酸鏈霉素在綿羊的肝臟和腎臟中代謝時間長,殘留量高;肌肉組織中代謝快,殘留量低。

3.2.4 綿羊內服伊維菌素,停藥17 d時檢測,以腎臟中的殘留量最高,肝臟和肌肉組織很少。

3.2.5 綿羊內服阿苯達唑,停藥7 d檢測,未檢出;綿羊內服左旋咪唑,停藥6 d檢測,未檢出;綿羊內服吡喹酮,停藥17、27和37 d時檢測,均未檢出。

3.2.6 肉雞42 d(出欄)時,新霉素在肉雞的胸肌和腿肌中殘留量最高,在肝臟和腎臟中的殘留量僅為肌肉組織的四分之一。

3.2.7 肉雞42 d(出欄)時,強力霉素在腎臟中的殘留量最高,是肌肉組織、心臟和肝臟殘留量的10倍多。

3.2.8 本試驗中各種藥物的殘留量均低于中國和歐共體(EEC)規(guī)定的標準殘留限量。

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