李麗麗，單路娟，張 媛，高船舟，劉越堅(jiān)，宋智琦

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 皮膚科，遼寧 大連 116011；2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116011；3.遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116021；4.大連醫(yī)科大學(xué) 中心實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116044)

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。谷氨酸受體(glutamate receptors，GluRs)分為兩大類，一類是離子型谷氨酸受體(iontropic glutamate receptors，iGluRs)，該類受體屬于配體門控離子通道，通道的啟閉受谷氨酸調(diào)控。其中甲基-D-天冬氨酸受體2A(N-methyl-D-aspartate receptors 2A,NMDAR2A)是具有強(qiáng)烈的電壓依賴性和高Ca2+滲透性的一種亞型。另一類是代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptors，mGluRs),該類受體是一類G蛋白偶聯(lián)受體，其中mGluR1可激活肌糖磷酸鹽代謝和細(xì)胞內(nèi)鈣的轉(zhuǎn)運(yùn)[1，2]。除了中樞神經(jīng)系統(tǒng)外，非神經(jīng)系統(tǒng)骨骼、睪丸、胰腺、肺臟、心臟以及皮膚組織等多種組織中已發(fā)現(xiàn)存在谷氨酸信號(hào)系統(tǒng)[3-6]。2009年有研究發(fā)現(xiàn)，表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(kerytinocytes,KCs)可分泌L-谷氨酸[7]；并且KCs具有谷氨酸受體NMDAR的表達(dá)，谷氨酸信號(hào)通路可能通過(guò)影響其細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度而影響KCs的增殖和分化[8，9]。現(xiàn)已證實(shí)表皮內(nèi)的黑素細(xì)胞(melanocytes,MCs)內(nèi)亦有NMDAR,α-氨基羥甲基異噁唑丙酸受體(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate receptor,AMPAR)等多種谷氨酸受體表達(dá)；并發(fā)現(xiàn)離子型谷氨酸受體AMPA抑制劑可下調(diào)MCs內(nèi)MITF基因(Microphthalmia- associated transcription factor)的表達(dá)[10]，而后者為與MCs功能密切相關(guān)的重要調(diào)控基因之一。為進(jìn)一步探討該信號(hào)通路在MCs中的作用，本研究進(jìn)行了原代MCs內(nèi)的離子型谷氨酸受體的蛋白表達(dá)檢測(cè)，同時(shí)觀察了干擾該信號(hào)通路下MCs樹突形態(tài)的變化。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

IMDM培養(yǎng)基，胎牛血清及胰酶(Gibico公司)，小鼠抗NMDAR2A單克隆抗體(Chemicon公司)，小鼠抗a-tubulin單克隆抗體(Gibico)公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗小鼠二抗(Gibico公司)，MK-801(Invitrogne公司)，Human Melanocyte Growth Supplem(HMGS)(Invitrogne公司)，Medium245(Invitrogne公司)，DispaseⅡ(Invitrogne公司)，N-Methyl-D-aspartic acid(NMDA)(Alexis Blomol公司)，Quisqualate(Q-LA)(Alexis Blomol公司)，Quanta 200F(型)掃描電鏡(美國(guó)FEI公司)。

1.2 原代MCs培養(yǎng)

1.2.1 分離培養(yǎng)：包皮為12～20歲泌尿外科包皮手術(shù)患者捐贈(zèng)。包皮用碘伏浸泡消毒10 min，PBS洗滌3次，去除皮下組織，將包皮剪成1 mm×3 mm的皮塊，用0.5%Dispase中性酶Ⅱ4℃消化16 h，分離表、真皮。用眼科剪將表皮剪成2 mm×2 mm的皮片，37°C下用0.25%胰酶消化表皮10 min，200目篩網(wǎng)過(guò)濾，PBS洗滌2次，離心獲取較純凈表皮MCs，MCs用加human melanocyte growth supplem(HMGS)的Medium245培養(yǎng)基稀釋，以4×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種到25 cm2的培養(yǎng)瓶中，于5%CO2，37℃條件下傳代培養(yǎng)，第3代細(xì)胞備用。

1.2.2 MCs鑒定：(1)多巴染色:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的MCs(2～3代)，0.25%胰酶消化,調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為5×105/mL接種于含有蓋玻片的培養(yǎng)皿中,連續(xù)培養(yǎng)48～72 h,觀察細(xì)胞在蓋玻片上的生長(zhǎng)情況。當(dāng)達(dá)到60%～70%時(shí),終止生長(zhǎng),4%多聚甲醛固定10 min,L-Dopa緩沖液孵育4～5 h,溫度37℃,鏡下觀察發(fā)現(xiàn)染液變?yōu)樽厣纯山K止。乙醇脫水、二甲苯透明、封片、陽(yáng)性反應(yīng)者細(xì)胞漿和樹突呈褐色至黑色。(2)透射電鏡觀察MCs超微結(jié)構(gòu):收集細(xì)胞，2.5%戊二醛固定后，經(jīng)脫水、滲透、包埋、超薄切片、鈾鉛染色等常規(guī)電鏡樣品制備程序，于日立H-7000型透射電鏡觀察細(xì)胞中的黑素小體及分期。

1.3 Western Blot方法測(cè)定人類原代MCs內(nèi)NMDAR2A的表達(dá)

收集MCs，用PBS緩沖液漂洗3次，離心，棄上清；視細(xì)胞密度酌情加入100～200 μL細(xì)胞裂解液RIPA，反復(fù)吹洗50次，冰上作用30 min；振蕩混勻，4℃下14000 r/min離心15 min；取上清液，100℃水浴中變性3～5 min，-20℃保存。而后采用考馬思亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析。進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳和Western blot檢測(cè)：細(xì)胞溶解液蛋白(25 μg)在4%積層膠和7.5%分離膠的SDS-PAGE上電泳；濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將膜浸入5%脫脂奶粉1 h封閉非特異性抗原，膜與一抗稀釋液鼠抗NMDAR2A(1∶1000)及鼠抗α-tubulin(1∶1000)4℃下孵育過(guò)夜；第二天TBST洗3次，15 min/次，分別加入二抗HRP標(biāo)記的抗鼠IgG(1∶5000)室溫孵育1 h，TBST洗3次，15 min/次，用ECL顯色系統(tǒng)曝光顯影。根據(jù)條帶的輝度判斷目的蛋白表達(dá)差異。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 掃描電鏡下觀察MCs樹突形態(tài)

取第3代MCs于6孔板蓋坡片上培養(yǎng)24 h，細(xì)胞密度30%左右，加入谷氨酸受體激動(dòng)劑(NMDA,Q-LA)和抑制劑(MK801)，48 h后，加入2.5%戊二醛固定后，常規(guī)掃描電鏡細(xì)胞樣品制作后，于美國(guó)FEI公司Quanta 200F型掃描電鏡觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 MCs的鑒定

為鑒定原代培養(yǎng)細(xì)胞，分別采用多巴染色及透射電鏡觀察。結(jié)果如下：多巴染色顯示胞漿內(nèi)呈黑褐色(圖1A、B)；掃描電鏡下可見細(xì)胞漿內(nèi)大量的成熟的黑素小體(圖1C、D)。

2.2 Western Blot測(cè)定MCs內(nèi)NMDAR2A的表達(dá)結(jié)果

Western Blot結(jié)果顯示，黑素細(xì)胞內(nèi)有NMDAR2A蛋白的表達(dá)(圖2)。

圖1 黑素細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定Fig 1 The identification of biological characteristics of melanocytesA,B：DOPA reactivity of melanocytes.Cells were cultured in medium supplemented with 5 mol/L DOPA under light microscopy(A×200,B×400)；C：Transmission electron micrographs of melanocytes(Scale bars = 2 μm)；D：The Stage III-IV melanosomes seen in cytoplasm of melanocytes(bar=500 μm)

圖2 NMDAR2A在黑素細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)Fig 2 The expression of ionotropic glutamate receptorNMDAR2A in human melanocytes Western blot was performed with 50 μg of protein lysates of normal melanocyte cells,Mouse brain lysate was loaded as a positive control(lane Ⅰ).170 kD product for NMDAR2A(lane Ⅱ)

2.3 掃描電鏡下觀察非競(jìng)爭(zhēng)性NMDAR拮抗劑MK801及NMDAR激動(dòng)劑N甲基D天門冬氨酸(NmethylDaspartate，NMDA)、AMPAR激動(dòng)劑使君子酸(Quisqualate，Q-LA)作用下MCs細(xì)胞樹突的變化

MCs在NMDAR激動(dòng)劑NMDA(200 μmol/L)和Q-LA(50 μmol/L)、非競(jìng)爭(zhēng)性NMDAR拮抗劑MK801(150 μmol/L)分別作用48 h后細(xì)胞的樹突形態(tài)發(fā)生變化。NMDA及Q-LA作用后細(xì)胞樹突變粗，末端二、三級(jí)樹突增加。MK801作用后細(xì)胞樹突末端明顯變窄，二、三級(jí)樹突減少(圖3 A)。采用JEOL Smile View 2.1軟件測(cè)量細(xì)胞樹突長(zhǎng)度(圖3B、C)，與陰性對(duì)照組比較，NMDA(200 μmol/L)和Q-LA(50 μmol/L)作用下樹突較短，P<0.05；非競(jìng)爭(zhēng)性NMDAR拮抗劑MK801(150 μmol/L)作用下樹突長(zhǎng)度無(wú)明顯變化。

圖3 NMDAR拮抗劑對(duì)黑素細(xì)胞樹突形態(tài)的影響Fig 3 The dendritic morphology changes of melanocyte treated by agonists or antagonist of NMDARA：Relative to the negative control group,human melanocytes in the antagonist effect of MK-801 dendritic cells in thin and narrow,two branches significantly reduced agonist NMDA and the AMPA under the action of short and thick dendritic cells,and secondary branches increased significantly(Scale bar,a=20 μm,b =10 μm,c=5 μm )；B ,C：Length of cell dendrites changes under agonists or antagonist of nmdar treatment measured by JEOL Smile View 2.1 software(Scale bar,200 μm;*P<0.05 vs control group)

3 討 論

谷氨酸是主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。除中樞神經(jīng)系統(tǒng)外，現(xiàn)已證實(shí)表皮內(nèi)亦存在谷氨酸信號(hào)通路。不僅占表皮主要細(xì)胞成分的KCs內(nèi)有谷氨酸受體表達(dá)，并且目前有研究發(fā)現(xiàn)MCs內(nèi)亦存在谷氨酸信號(hào)通路。已證實(shí)離子型谷氨酸受體NMDAR2A、2C及AMPAR在MCs內(nèi)有表達(dá)。并發(fā)現(xiàn)AMPAR拮抗劑可下調(diào)MCs內(nèi)MITF(Microphthalmia- associated transcri- ption factor)基因的表達(dá)[10]。提示該信號(hào)通路與MITF基因具有相互作用。而大量研究發(fā)現(xiàn)MITF對(duì)于MCs增殖等多種生物學(xué)功能具有調(diào)節(jié)作用。MCs內(nèi)高表達(dá)的MITF可促進(jìn)細(xì)胞分化，惡性黑素瘤內(nèi)MITF上調(diào)可抗惡黑細(xì)胞增殖[11]；同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)患者皮損處的表皮組織內(nèi)，MITF及BCL-2的mRNA水平較白癜風(fēng)患者非皮損處明顯下降[12]。因此，作者推測(cè)谷氨酸信號(hào)通路可能通過(guò)MITF參與白癜風(fēng)的發(fā)病。

白癜風(fēng)的發(fā)病過(guò)程中表皮MCs受損，從而導(dǎo)致具有正常生理功能的MCs的數(shù)目下降，但其具體發(fā)生機(jī)制目前尚不十分清楚[13]。Tobin等[14]研究了白癜風(fēng)患者的皮損發(fā)現(xiàn)即使在穩(wěn)定期的發(fā)病20年以上的患者的皮損處仍存在部分MCs。從皮損處發(fā)皰取表皮，仍可在體外培養(yǎng)出有產(chǎn)生黑素功能的MCs，提示當(dāng)致病因素排除后MCs可恢復(fù)功能。一項(xiàng)在泛發(fā)性白癜風(fēng)患者及正常對(duì)照的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，患者皮損處經(jīng)摩擦后MCs變圓并部分脫離基底層，“脫落”至棘細(xì)胞層及顆粒細(xì)胞層，而患者的正常皮膚或正常對(duì)照組則較少或無(wú)MCs移入表皮現(xiàn)象。推測(cè)白癜風(fēng)發(fā)病過(guò)程中皮損處MCs數(shù)量的減少可能與“脫落”現(xiàn)象有關(guān)，而后者可能與MCs變圓等形態(tài)學(xué)改變有關(guān)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)在NMDAR拮抗劑MK801作用下，可使MCs產(chǎn)生樹突變細(xì)以及二、三級(jí)細(xì)胞樹突明顯減少等超微結(jié)構(gòu)的變化，推測(cè)這種超微結(jié)構(gòu)的變化有可能是造成MCs的遷移及脫落的原因。同時(shí)，近期有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸信號(hào)通路與淋巴細(xì)胞的功能有關(guān)[16-18]。本研究結(jié)果提示，谷氨酸信號(hào)通路的調(diào)節(jié)異?？赡転榘遵帮L(fēng)的發(fā)病機(jī)制之一,探討其作用機(jī)制對(duì)于色素異常性皮膚病的治療具有重要意義。

[1] Monaghan DT,Bridges RJ,Cotman CW.The excitatory amino acid receptors:their classes,pharmacology,and distinct properties in the function of the central nervous system[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol,1989,29:365-402.

[2] Dingledine R,Borges K,Bowie D,et al.The glutamate receptor1 on channels[J].Pharmacol Rev,1999,51:7-61.

[3] Genever PG,Maxfield SJ,Kennovin GD,et al.Evidence for a novel glutamate -mediated signaling pathway in keratinocytes[J].J Invest Dermatol,1999,112:337-342.

[4] Itzstein C,Cheynel H,Burt-Pichat B,et al.Molecular identification of NMDA glutamate receptors expressed in bone cells[J].J Cell Biochem,2001,82(1):134-144.

[5] Cho JH,Chen L,Kim MH,et al.Characteristics and functions of {alpha}-amino -3- hydroxy -5- methyl- 4 -isoxazole propionate receptors expressed in mouse pancreatic {alpha}-cells[J].Endocrinology,2010,151 (4):1541-1550.

[6] Spanaki C,Zaganas I,Kleopa KA,et al.Human GLUD2 glutamate dehydrogenase is expressed in neural and testicular supporting cells[J].J Biol Chem，2010，285(22):16748-16756.

[7] Fischer M,Glanz D,Urbatzka M,et al.Keratinocytes:a source of the transmitter L-glutamate in the epidermis[J].Exp Dermatol,2009,18(12):1064 -1066.

[8] Fischer M,Glanz D,William T,et al.N-methyl-D-aspartate receptors influence the intracellular calcium concentration of keratinocytes[J].Exp Dermatol,2004,13(8):512-519.

[9] Fischer M,Fiedler E,Seidel C,et al.Cultivated keratinocytes express N-methyl-D-aspartate receptors of the NMDAR2D type[J].Arch Dermatol Res,2006,297(7):316-318.

[10] Hoogduijn MJ,Hitchcock IS,Smit NP,et al.Glutamate receptors on human melanocytes regulate the expression of MiTF[J].Pigment Cell Res,2006,19(1):58-67.

[11] Wellbrock C,Marais R.Elevated expression of MITF counteracts B-RAF stimulated melanocyte and melanoma cell proliferation[J].J Cell Biol,2005,170:703-708.

[12] Kingo K,Aunin E,Karelson M,et al.Expressional changes in the intracellular melanogenesis pathways and their possible role in the pathogenesis of vitiligo[J].J Dermatol Sci,2008,52(1):39-46.

[13] Huggins RH,Schwartz RA,Janniger CK.Vitiligo[J].Acta Dermatovenerol Alp Panonica Adriat,2005,14(4):137-142,144-145.

[14] Tobin DJ,Swanson NN,Pittelkow MR,et al.Melanocytes are not absent in lesional skin of long duration vitiligo[J].J Pathol,2000,191(4):407-416.

[15] Gauthier Y,Cario-Andre M,Lepreux S,et al.Melanocyte detachment after skin friction in non lesional skin of patients with generalized vitiligo[J].Br J Dermatol,2003,148(1):95-101.

[16] Ganor Y,Grinberg I,Reis A,et al.Human T-leukemia and T-lympho-maexpress glutamate receptor AMPA GluR3,and the neurotransmitter glutamate elevates the cancer-related matrix- metalloproteinases inducerCD147/EMMPRIN,MMP-9 secretion and engraftment of T-leukemia in vivo[J].Leuk Lymphoma，2009,50(6):985- 997.

[17] Kvaratskhelia E,Maisuradze E,Dabrundashvili NG,et al.N-methyl-D-aspartate and sigma-ligands change the production of interleukins 8 and 10 in lymphocytes through modulation of the NMDA glutamate receptor[J].Neuroimmunomodulation,2009,16(3):201-207.

[18] Chen G,Han G,Feng J,et al.Glutamic acid decarboxylase-derived epitopes with specific domains expand CD4(+) CD25(+) regulatory Tcells[J].PLoS One,2009，4(9):e7034.