廖前進(jìn) 蘇 堅(jiān) 何 潔 宋 穎 唐海林 蘇 琦

二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)是大蒜中的主要成分之一，前期研究發(fā)現(xiàn)DADS能抑制胃癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞的生長[1,2]，本實(shí)驗(yàn)以人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞為研究對象，觀察DADS對SW480細(xì)胞系裸鼠成瘤的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和動物

人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中(Gibco公司產(chǎn)品)。在含5%CO2的37℃溫箱中培養(yǎng)，每2天傳一代。

裸鼠15只，BALB/c/nu/nu品系，雄性，4～6周齡，16～20 g，由中科院上海實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物質(zhì)量合格證號為SCXK(滬)2003-0003。動物飼喂于無特定病原體(specified-pathogens free，SPF)環(huán)境中，食物和飲水經(jīng)滅菌處理后傳遞投入，自由攝取，光照和氣體交換速率等同正常飼養(yǎng)繁育條件。

1.2 藥品與試劑

DADS為 Fluka公司產(chǎn)品，分子量為146.28D，純度80%。DADS與Tween80以1∶2的比例充分溶解后，加入體積分?jǐn)?shù)為0.90的生理鹽水稀釋100倍，振蕩混勻，作為母液保存于-20℃冰箱中，臨用時將此母液稀釋至所需濃度。增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)單克隆抗體、p21WAF1單克隆抗體為Santa Cruz 公司產(chǎn)品，免疫組化試劑盒購自福州邁新公司。

1.3 裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分組：15只裸鼠隨機(jī)分為對照組、預(yù)防組及體外處理組，每組5只。動物在無特定病原體(SPF)環(huán)境中飼養(yǎng)，食物和飲水經(jīng)滅菌處理后傳遞投入，自由攝取，光照和氣體交換速率等同正常飼養(yǎng)繁育條件。

裸鼠移植：體外處理組(5只)將體外DADS(50 μg/ml)處理48 h后的SW480細(xì)胞，0.25%的胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)拒染法記數(shù)活細(xì)胞數(shù)占95%以上，將細(xì)胞密度調(diào)至2×106個/ml，每只裸鼠取0.2 ml細(xì)胞懸液接種于右大腿背側(cè)皮下。余10只裸鼠取處于對數(shù)生長期的SW480細(xì)胞接種，收集細(xì)胞、過程及接種方法同前，接種后次日隨機(jī)分為預(yù)防組和對照組(每組5只)，預(yù)防組腹腔內(nèi)注射DADS(15 mg/kg)，對照組腹腔注射相同體積生理鹽水，均隔日注射1次，連續(xù)給藥10次。3組均每4天測腫瘤體積1次，并計(jì)算腫瘤體積(V)，V=ab2/2(a為長度，b為寬度)，以每組動物移植瘤體積的平均值，繪制移植瘤生長曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時在超凈工作臺上完整剝離腫瘤，用電子天平稱量移植瘤重量，每組分別取部分移植瘤組織固定于10% 的中性甲醛中，其余均-80℃超低溫冰箱保存。計(jì)算瘤重抑瘤率。

瘤重抑瘤率(%)=(1-處理組瘤重/對照組瘤重)×100%

1.4 組織形態(tài)學(xué)觀察

取部分移植瘤組織，10%甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片作HE染色，光鏡下觀察組織學(xué)形態(tài)。

1.5 免疫組織化學(xué)

按照免疫組化試劑盒說明書逐步操作，將石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化后，用PBS沖洗3次，每次5 min；每張切片加一滴過氧化酶阻斷劑(試劑A)，室溫下孵育10 min；再用PBS洗3次后，滴加非免疫性動物血清(試劑B)，37℃孵育5 min；棄去非免疫性動物血清；滴加一抗，4℃過夜；PBS洗3次后再滴加二抗(試劑C)，37℃孵育10 min；PBS洗3次后滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶溶液(試劑D)，37 ℃孵育10 min；PBS洗3次后，用新鮮配制的 DAB顯色液顯色，顯微鏡下觀察2～5min；自來水沖洗，蘇木精淺染，自來水沖洗返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。應(yīng)用重慶天海醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn)的病理圖像分析系統(tǒng)，進(jìn)行灰度掃描定量分析。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)

處死裸鼠后剝出移植瘤稱重后切取瘤組織15 mg，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108個/L，用4℃的70%乙醇固定，碘化丙啶DNA染色法，室溫下上機(jī)分析，應(yīng)用Coulter公司生產(chǎn)的Epics XL流式細(xì)胞儀檢測群體細(xì)胞中G0/G1、S、G2/M期細(xì)胞百分率。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠生長及成瘤情況

整個實(shí)驗(yàn)過程中裸鼠飲水、進(jìn)食正常且無腹瀉、活動遲緩等不良反應(yīng)，無一荷瘤裸鼠自然死亡。對照組裸鼠均有移植瘤形成，出瘤時間平均為6天，體外處理組2只移植瘤形成，出瘤時間平均為10天，預(yù)防組3只有移植瘤形成，出瘤時間平均為8天。裸鼠皮下移植瘤境界清楚，似有包膜，腫瘤表面凸凹不平，成多個結(jié)節(jié)融合狀。對照組腫瘤生長迅速，瘤體積較大，其他2組移植瘤生長緩慢，瘤體積較小。

2.2 DADS對SW480細(xì)胞裸鼠致瘤的影響

實(shí)驗(yàn)過程中檢測瘤體積變化，繪制移植瘤生長曲線。隨著時間的延長，移植瘤逐漸增大，與對照組相比，體外處理組和預(yù)防組移植瘤生長速度顯著減慢(圖1)。由表1可見，SW480細(xì)胞經(jīng)DADS體外處理后，其致瘤能力明顯降低，體內(nèi)DADS對人結(jié)腸癌的發(fā)生有預(yù)防作用；體外處理組和預(yù)防組與對照組比較，移植瘤體積、瘤重均有顯著性差異(P均<0.05)。

圖1 DADS對人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的影響

表1 DADS對SW480細(xì)胞裸鼠移植瘤體積、瘤重的影響

注：*為與對照組比較P<0.05

2.3 DADS對癌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

HE染色光鏡下觀察腫瘤組織為低分化腺癌。對照組瘤細(xì)胞排列緊密且紊亂，異型性大，以圓形或橢圓形為主，核染色深，核仁大而明顯，核分裂多；體外處理組、預(yù)防組癌巢較清楚，可見腺樣結(jié)構(gòu)，癌細(xì)胞大小較均勻，胞質(zhì)透亮狀改變，部分癌細(xì)胞水變性，核固縮，核分裂相減少，部分癌細(xì)胞呈凋亡早期改變。

2.4 DADS對裸鼠移植瘤細(xì)胞PCNA、p21WAF1蛋白表達(dá)的影響

采用免疫組織化學(xué)法，檢測裸鼠移植瘤細(xì)胞PCNA、p21WAF1蛋白表達(dá)情況。3 組移植瘤組織中PCNA蛋白均呈陽性表達(dá)，呈淡黃色或棕黃色染色，定位于胞核；p21WAF1蛋白陽性表達(dá)主要定位于胞核中，對照組移植瘤組織中p21WAF1蛋白呈陰性表達(dá)，而體外處理組和預(yù)防組移植瘤組織中其呈陽性表達(dá)。經(jīng)圖像灰度掃描分析可見，與對照組相比，體外處理組和預(yù)防組PCNA蛋白表達(dá)明顯減弱(P<0.05)，而p21WAF1蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)，見表2。

表2 DADS對移植瘤細(xì)胞PCNA、p21WAF1蛋白表達(dá)灰度分析

注：*為與對照組比較P<0.05，**為與對照組比較P<0.01

2.5 流式細(xì)胞儀檢測移植瘤細(xì)胞周期分布

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，各處理組與對照組比較，裸鼠移植瘤細(xì)胞周期分布發(fā)生了明顯的改變， 處于G2/M 期細(xì)胞顯著增多，與對照組比較有顯著性差異(P<0.01)，即DADS能改變?nèi)私Y(jié)腸癌SW480細(xì)胞裸鼠移植瘤的周期分布，阻滯于G2/M 期，見圖2。

圖2 DADS處理后裸鼠移植瘤細(xì)胞的周期分布 A、B、C分別為對照組、預(yù)防組、體外處理組

3 討論

結(jié)腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，在歐美國家居各種惡性腫瘤發(fā)生率和死亡率的第三位，在亞洲居于第四位，嚴(yán)重威脅人民健康與生命，隨著人民生活水平的不斷提高，有逐漸上升的趨勢[3]。流行病學(xué)資料顯示，在食用大蒜的人群中，結(jié)腸癌的發(fā)生率及死亡率均低于忌用大蒜的人群[4]。DADS是大蒜中提取的1種低分子量的脂溶性成分，也是大蒜中的主要有效成分，DADS對多種腫瘤均有明顯的抑制作用[5～7]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上研究了DADS對人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞裸鼠成瘤的影響。結(jié)果顯示，DADS能明顯降低SW480細(xì)胞裸鼠的致瘤性，且在體內(nèi)對人結(jié)腸癌的發(fā)生有預(yù)防作用。

細(xì)胞增殖核抗原PCNA僅在增殖細(xì)胞中合成或表達(dá)的核內(nèi)多肽，為真核細(xì)胞增殖所必須，是決定細(xì)胞存亡的關(guān)鍵蛋白[8]。PCNA表達(dá)和合成與細(xì)胞周期有關(guān)，可以作為反應(yīng)細(xì)胞增殖速度的1個標(biāo)志，主要表達(dá)于增殖細(xì)胞的S期、G1期和G2初期，在細(xì)胞中表達(dá)較高時，細(xì)胞DNA可以復(fù)制或修復(fù)，而表達(dá)較低時，細(xì)胞則凋亡[9]。p21WAF1屬CDKI家族，是第1個被發(fā)現(xiàn)的CDK抑制物。p21WAF1具有兩個獨(dú)特的功能區(qū)，其N-端部分的殘基介導(dǎo)CDK的阻斷效應(yīng)，其C-端可以和PCNA結(jié)合，抑制DNA的復(fù)制，從而抑制細(xì)胞增殖。近年來許多研究表明p21WAF1參與了G2/M期的調(diào)控。白葉藤堿通過誘導(dǎo)p21蛋白的表達(dá)引起人骨肉瘤細(xì)胞G2/M期阻滯[10]；冬蟲夏草可通過p21蛋白的介導(dǎo)引起膀胱癌G2/M期[11]。在M期p21WAF1核內(nèi)聚集，可引起細(xì)胞停滯在G1、G2期；S期p21WAF1表達(dá)，可導(dǎo)致G2期阻滯[12]。Gotoh等將p21重組腺病毒載體導(dǎo)入到雄激素依賴和非依賴性的前列腺癌細(xì)胞系LNCaP、DUl45和PC-3中，發(fā)現(xiàn)這些癌細(xì)胞裸鼠致瘤率降低[13]。在本研究中同樣發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)外SW480細(xì)胞經(jīng)DADS處理后，其增殖能力明顯減弱，裸鼠致瘤率降低，細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，且瘤組織中PCNA蛋白表達(dá)明顯減弱，p21WAF1蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。由此提示，DADS可明顯降低人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的致瘤能力，抑制SW480細(xì)胞增殖，引起G2/M期阻滯，其機(jī)制可能與抑制PCNA蛋白表達(dá)，增強(qiáng)p21WAF1蛋白表達(dá)有關(guān)。

[1] 袁靜萍，凌 暉，張孟賢，等.二烯丙基二硫誘導(dǎo)人胃癌MGC803細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯的研究〔J〕.中國藥理學(xué)通報(bào)，2004，20(3)：299.

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