李　燦　李子忠　鄭興旺　周　波　曹　宇

摘要：用高濃度CO₂氣體脅迫處理藥材甲老熟幼蟲及體外磷酸酯酶，通過終點(diǎn)法測定酶活性變化，分析氣調(diào)脅迫與磷酸酯酶活性變化之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，高濃度CO₂密閉處理藥材甲老熟幼蟲6 h和12 h，ACP比活力分別升高6.41％和18.96％，ALP活力分別降低了7.69％和7.91％。ACP經(jīng)CO₂體外處理30、60、120 min，比活力分別增強(qiáng)92.77％、127.43％和67.91％?？梢?，高濃度CO₂氣調(diào)脅迫處理對藥材甲老熟幼蟲ACP和ALP活力均有一定影響。

關(guān)鍵詞：藥材甲；高濃度CO₂氣調(diào)；磷酸酯酶；比活力

中圖分類號：Q 965．9

儲藏產(chǎn)品，尤其是直接供人畜食用或藥用的產(chǎn)品害蟲防治策略與大田農(nóng)業(yè)害蟲防治策略有根本的區(qū)別，前者對農(nóng)藥殘留問題更為重視。藥材甲[Stegobium paniceum(L.)]隸屬于鞘翅目(Coleop-tera)竊蠹科(Anobiidae)，是一種典型的世界性分布儲藏物甲蟲，近年在貴陽地區(qū)發(fā)生和為害猖獗，藥業(yè)損失嚴(yán)重。該蟲是最常見的中藥材儲藏期害蟲之一，已有研究證明利用高濃度CO₂和低濃度O₂協(xié)同作用來控制儲藏物害蟲安全可行、健康環(huán)保，作者嘗試了高濃度CO₂氣調(diào)在中藥材害蟲防治中的應(yīng)用，開展了藥材甲氣調(diào)毒理學(xué)的基礎(chǔ)研究。

酯酶性質(zhì)的研究一向是昆蟲毒理學(xué)研究的主要內(nèi)容之一，磷酸酯酶因其在昆蟲抗藥性發(fā)展中的作用也受到許多關(guān)注。磷酸酯酶有酸性磷酸酯酶(acid phosphatases，ACP)和堿性磷酸酯酶(alkalinephosphatases，ALP)兩類，分別在相應(yīng)的酸堿性條件下，能夠水解對硝基苯基磷酸二鈉產(chǎn)生黃色物質(zhì)對硝基苯酚。生物組織損傷會影響到ACP所在腸道的正常生理平衡，進(jìn)而影響到該酶的活性，導(dǎo)致機(jī)體中毒。有機(jī)磷和擬除蟲菊酯類以及其他外源性有毒物質(zhì)均能引起該酶活性的變化。顏增光等的研究表明，高濃度的光活化毒素a-三噻吩(a-ter-thienyl，a-T)對棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)和亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)的ACP和ALP離體活性均有抑制作用。Nathan等的研究表明，印楝素和核多角體病毒(Nucleopolyhedrovirus)能夠抑制斜紋夜蛾(Spodoptera litura)中腸的兩種磷酸酯酶的活性，檸檬苦素(limonoids)對稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocis medinalis)幼蟲和蛹期的ALP和ACP具有相同的作用。

本研究將CO₂作為外源毒物，通過高濃度脅迫處理藥材甲老熟幼蟲，比較研究氣調(diào)處理前后磷酸酯酶活性的變化，以期為氣調(diào)殺蟲機(jī)理的研究以及昆蟲抗氣性治理提供基礎(chǔ)資料。

1材料與方法

1．1供試蟲源

藥材甲于2002年采自貴陽市藥材公司，在人工氣候?qū)嶒炇?29±1)℃、相對濕度(75±5)％、光照14h條件下飼養(yǎng)，以中藥材狼毒(Radix euphorbiae Fis-cherianae，購自貴陽市藥材公司)為食料。試驗時已人工飼養(yǎng)15代以上，以3～4齡老熟幼蟲作為試蟲。

1．2主要化學(xué)試劑及儀器設(shè)備

對硝基苯基磷酸二鈉(Merck)和對硝基苯酚為天津光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn)品，巴比妥鈉為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，考馬斯亮藍(lán)G-250為sigma產(chǎn)品，牛血清白蛋白為Roche產(chǎn)品；酶標(biāo)儀(Tecan產(chǎn))；高速冰凍離心機(jī)(sigma產(chǎn))。

1．3生物測定與昆蟲氣調(diào)處理

同齡老熟幼蟲60頭置于20 cm×30 cm×20 cm可充氣密閉塑料培養(yǎng)盒中，用氣體混配儀(長沙長錦科技有限公司產(chǎn))通人CO₂和空氣的混合氣體，CO₂占75％，空氣占25％(體積比)，分別處理6～54 h，相同環(huán)境條件下空氣處理作為對照。死亡標(biāo)準(zhǔn)確定：處理昆蟲移出氣調(diào)環(huán)境，室溫條件恢復(fù)6 h后，以毛刷子刺激不動視為死亡。試驗重復(fù)3次。

1．4酶液提取與制備

本研究分別進(jìn)行了高濃度CO₂處理幼蟲后提取酶液和對未處理過的昆蟲提取酶液進(jìn)行體外處理兩類試驗。前者酶液提取方法為：取老熟幼蟲30頭，置于20 cm×30 cm×20 cm密閉培養(yǎng)盒中，通入高濃度CO₂氣體分別處理o h(置于空氣環(huán)境中，作為對照處理)、6 h和12 h(根據(jù)生物測定結(jié)果，處理時間內(nèi)死亡率在10％以下)，轉(zhuǎn)入玻璃勻漿器，加入預(yù)冷處理的pH 4.6，0.2 mol／L醋酸緩沖液0.4 mL，冰液充分勻漿，后加入7.6 mL相同緩沖液混勻，分裝于8支1.5 mL離心管，于10 000 r／min，4℃離心15 min，取上清液于4℃冰箱中保存，24 h內(nèi)使用。體外處理試驗則將未經(jīng)CO₂處理的昆蟲，直接如上述方法提取酶液，活性測定試驗前，酶液用高濃度CO₂進(jìn)行體外處理。

堿性磷酸酯酶ALP的提取方法同ACP提取，將緩沖液改為pH 9.6，0.04 mol／L巴比妥鈉一鹽酸緩沖液即可。

1．5酶液體外處理

將未處理幼蟲直接提取的酶液混勻分裝于4支相同的試管中，置于37℃恒溫水浴，持續(xù)通入高濃度CO₂氣體，流速100mL／min，分別處理30、60、120 min時測定酶活性，取等量酶液不通氣置于相同水浴溫度條件下，靜置對應(yīng)時間作對照處理。

1．6制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

用去離子水配制7.5 mmol／L對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，于8支5 mL試管中分別加入標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mL，用0.2 m01／L醋酸緩沖液配平至3.0 mL，于37℃水浴靜置30 min后取出，加入0.2 mol／L氫氧化鈉溶液2.0 mL，室溫靜置10 min后于400 nm處測OD值。以對硝基苯酚濃度為自變量(x)，其在400 nm處的OD值為因變量(y)，回歸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對硝基苯酚在酸性條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

如上方法，將緩沖液換為0.04 mol／L巴比妥鈉一鹽酸緩沖液，氫氧化鈉濃度調(diào)整為0.1 mol／L，制作對硝基苯酚在堿性條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線。同樣，配制牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，設(shè)定不同濃度于595 nm處測定OD值，以牛血清白蛋白濃度作自變量(x)，其在595 nm處的吸光度值為因變量(y)，得到標(biāo)準(zhǔn)

曲線。

1．7酶活性測定和數(shù)據(jù)處理

參照Bradford等的方法，用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定酶源蛋白含量，以牛血清白蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。參照Bessey的方法，用對硝基苯酚制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。底物對硝基苯基磷酸二鈉在磷酸酯酶的作用下，水解生成對硝基苯酚，在堿性條件下呈黃色，于400 nm波長處比色測定OD值。酶活性測定反應(yīng)體系中含5×10^-4mol／L對硝基苯基磷酸二鈉0.5 mL，酶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，反應(yīng)總體積用0.2 mol／L醋酸緩沖液配平至3.0 mL，混合液于37℃恒溫水浴反應(yīng)30 min后，立即加入0.2 mol／L氫氧化鈉2.0 mL終止反應(yīng)(測定ALP活性時將氫氧化鈉濃度換為0.1 mol／L，緩沖液換為0.04 mol／L巴比妥鈉－鹽酸緩沖液)，室溫靜置10 min，于400nm處測定OD值。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和酶源蛋白含量的測定結(jié)果，將酶液用量(mL)轉(zhuǎn)換成酶液蛋白含量(mg)，將酶活性測定結(jié)果的OD值換算為相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對硝基苯酚的量(μmol)，然后以蛋白質(zhì)含量(mg)為橫坐標(biāo)，對硝基苯酚的量(μmol)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸制作活力曲線，該曲線的斜率即為相應(yīng)ACP或ALP的比活力μmol／mg·(30 min)^-1。

2結(jié)果與分析

2．1生物測定

藥材甲老熟幼蟲經(jīng)高濃度CO₂處理后，死亡率曲線如圖1所示。處理18 h內(nèi)，藥材甲幼蟲死亡率均很低，多數(shù)處于昏迷狀態(tài)，移出處理環(huán)境6 h可復(fù)活，屬于“擊倒”不記人死亡。處理30 h時，平均死亡率升高至50％。經(jīng)回歸分析(SPSS 11.5，Probit Analysis)，半數(shù)死亡時間LT₅₀為30.022 h，95％置信限為28.588～31.426 h?？梢姡绻枰ㄟ^高濃度CO₂氣調(diào)處理來殺滅藥材甲幼蟲，全面密閉處理48 h是必要的。實(shí)踐中還應(yīng)考慮藥材甲幼蟲蛀食于藥材內(nèi)部為害的特點(diǎn)，因此，處理時間應(yīng)超過48 h。

2．2標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)用

對硝基苯酚在酸／堿性條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為：y_a=11.624 x+0.004，R²=0.999 3^**；yb=11.377 x+0.002，R²=0.998^**。牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.018 6 x+0.026，R²=0.998^**，用作酶源蛋白含量定量測定標(biāo)準(zhǔn)。以上3個標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系均極顯著。

2．3藥材甲老熟幼蟲高濃度CO₂脅迫下磷酸酯酶比活力

藥材甲老熟幼蟲經(jīng)高濃度CO₂密閉處理6 h和12 h，其磷酸酯酶活力曲線如表1所示。曲線斜率即為相應(yīng)處理下的磷酸酯酶比活力。老熟幼蟲在高濃度CO₂環(huán)境中密閉處理6 h和12 h，其ACP比活力分別升高6.41％和18.96％，而ALP活力則分別降低了7.69％和7.91％。

2．4藥材甲老熟幼蟲ACP酶液體外處理后酶活力

未經(jīng)高濃度CO₂處理之藥材甲老熟幼蟲提取ACP，酶液經(jīng)體外持續(xù)通入高濃度CO₂氣體處理30、60、120 min，其活力曲線如表2所示。曲線的回歸方程斜率即為相應(yīng)處理下的ACP比活力。高濃度CO₂體外處理30、60、120 min，比活力分別增強(qiáng)92.77％、127.43％和67.91％。可見，藥材甲老熟幼蟲ACP在高濃度CO₂體外處理下，其比活力有不同程度的升高。

3結(jié)論與討論

磷酸酯酶性質(zhì)的改變是導(dǎo)致昆蟲對有機(jī)磷類等農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的原因之一，昆蟲可以通過磷酸酯酶活性的增強(qiáng)來提高對外源性毒物的解毒能力，這種能力最終發(fā)展為抗性，昆蟲對氣調(diào)處理產(chǎn)生抗性與若干酶的活性變化有關(guān)。過去人們對CO₂氣調(diào)處理對昆蟲作用的研究，主要集中于通過CO₂與其他氣體的配比設(shè)計來提高對昆蟲的殺傷效果，很少有研究關(guān)注CO₂氣調(diào)處理對昆蟲生理生化活動的影響，目前還沒有發(fā)現(xiàn)有關(guān)CO₂氣調(diào)處理對藥材甲磷酸酯酶活力影響的正式報道。本研究中高濃度CO₂氣調(diào)處理藥材甲老熟幼蟲可導(dǎo)致其磷酸酯酶活力的變化，高濃度CO₂氣體作用于藥材甲老熟幼蟲機(jī)體，其體內(nèi)的ACP活性增強(qiáng)，ALP活性稍微受到抑制，高濃度CO₂對ALP和ACP活性作用不一致，可能與CO₂進(jìn)入蟲體內(nèi)富集后，改變了體液的酸堿性平衡有關(guān)，因pH降低，致使堿性磷酸酯酶活力受到抑制。

藥材甲老熟幼蟲未經(jīng)CO₂處理提取ACP，酶液經(jīng)高濃度CO₂體外處理30～120 min，其比活力均顯著升高，這個結(jié)果與高濃度CO₂直接處理藥材甲幼蟲相似，其差異在于體外處理的作用更明顯，說明CO₂對藥材甲幼蟲ACP確有激活作用。這一結(jié)果與其他已知的外源性毒物如a-T等對昆蟲作用的方式不一致，a-T的作用抑制了ACP和ALP的活性，而高濃度CO₂作用雖然對ALP有輕微的抑制作用，但卻激活了ACP的解毒能力，可見，高濃度CO₂氣調(diào)的殺蟲與a-T的作用機(jī)理可能是不同的。這一結(jié)果的發(fā)現(xiàn)，對于認(rèn)識氣調(diào)作用對儲藏物害蟲控制的作用機(jī)理有積極意義。